陳洋

摘 要：總大腸菌群主要來源于人和溫血動物的糞便，是評定水被糞便污染的重要指示菌。糞便中除一些正常細菌外，還有許多致病微生物存在，如沙門氏菌、志賀氏菌、腸道病毒等。所以，水樣中有糞便污染，可看作對人體健康存在潛在的危害。通過對總大腸菌群數(shù)高低的檢測，指示了水被糞便污染的程度，同時也反映了對人體健康危害性的大小。

總大腸菌群是人為議定的一個名詞，指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。它除埃希氏菌屬外，還包括腸桿菌科的檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬等。目前，多采用多管發(fā)酵法和濾膜法檢測。多管發(fā)酵法以最可能數(shù)（MPN）表示，適用于生活飲用水及其水源水的測定。濾膜法以（CFU）/100mL）表示，適用于生活飲用水及低濁度的源水測定，本次試驗采用多管發(fā)酵法。

1、 試驗原理

l.1乳糖發(fā)酵試驗中，大腸菌群能分解乳糖而產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基的pH值降低（指示劑變色）。這一現(xiàn)象可作為觀察結(jié)果的指示。在酸性環(huán)境下，由于甲酸脫氫酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量氣體而進入導(dǎo)管中，以觀察產(chǎn)氣情況。

1.2分離培養(yǎng)時，大腸菌群細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使伊紅和美藍結(jié)合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有時產(chǎn)生金屬光澤。該培養(yǎng)基在高壓消毒時，忌溫度過高和反復(fù)加溫溶化。因為乳糖在高溫下不穩(wěn)定會分解成葡萄糖和半乳糖，傾注平皿后，在冰箱中4℃下保存不超過14天。

2、試劑及儀器

2.1試劑

2.1.1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

2.1.2伊紅美蘭培養(yǎng)基

2.1.3結(jié)晶紫染色液

2.1.4革蘭氏碘液

2.1. 5沙黃復(fù)染液

2.1.6乙醇脫色液

2.2儀器

2.2.1培養(yǎng)箱：37±1℃

2.2.2生物實體顯微鏡 OLYMPUS

2.2.3平皿：直徑為9cm

2.2.4試管

2.2.5分度吸管：lml，10ml

2.2.6錐形瓶

2.2.7小倒管

2.2.8載玻片

3、多管發(fā)酵法的測定

3.l乳糖發(fā)酵試驗

取源水一瓶充分搖勻接種l.0、0.1、0.01mL于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中。每個 稀釋度接種5管，每個水樣接種15管。每遞增稀釋一次，換用一支1mL滅菌分度吸管，將接種管置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h。對產(chǎn)酸產(chǎn)氣者按下列步驟進行。

3.2分離培養(yǎng)

將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)箱培內(nèi)，培養(yǎng)18～24h。分別記錄下菌落色澤與菌落形態(tài)。

3. 3驗證試驗

對各種色澤和形態(tài)的菌落作染色鏡檢。如為陰性無芽胞桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24士2h。有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即為總大腸菌群。否則可報告總大腸菌群陰性。

4、菌落色澤與檢出率的關(guān)系

通過對伊紅美藍平板上不同色澤的菌落進行驗證試驗，得出菌落色澤與檢出率的關(guān)系如下：

可見顏色較深的菌落，其檢出率大于顏色較淺的菌落。這是因為大腸菌群細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使伊紅和美藍結(jié)合成黑色化合物，使菌落呈黑紫色，而不發(fā)酵乳糖的細菌則為無色菌落。

5、菌落形態(tài)與檢出率的關(guān)系

觀察不同形態(tài)的菌落，作驗證試驗，得出菌落形態(tài)與檢出率的關(guān)系如下：

由上表可以看出，菌落形態(tài)光滑、圓潤凸起的檢出率要大于菌落干燥、扁平的菌落。

6、結(jié)果與討論

通過試驗，總大腸菌群檢出率高的菌落大致符合下列特征：

菌落形態(tài)光滑、圓潤、凸起、菌落顏色為深紫黑色，具有金屬光澤：紫黑色，不帶或略帶金屬光澤：淡紫紅色，中心較深的菌落。

另外，在乳糖發(fā)酵試驗中，常遇到產(chǎn)氣量少或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的情況。有時倒管內(nèi)雖無氣體，但在液面和管壁上卻可以看到緩緩上浮的氣泡。這時可延時培養(yǎng)再觀察。一般情況下，產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關(guān)。

參考文獻：

〔1〕生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范2001，198～201

〔2〕水和廢水標準檢驗法第三版472～476

〔3〕張宏陶，《水質(zhì)分析大全》，科學(xué)技術(shù)文獻出版社，1989

〔4〕中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生研究所，《地面水水質(zhì)監(jiān)測檢驗方法注解》，1980