肖建中 鄒湘月 顏新培 邵元元 葉添梅 李霞

(湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南 長沙 410127)

靈芝(Ganodermalucidum)，屬擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌[1]，又稱“仙草”、“瑞草”，自古以來就是我國的一味傳統(tǒng)名貴藥材。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和臨床研究結(jié)果表明，靈芝具有保肝護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤的藥理作用[2-3]，有關(guān)靈芝的開發(fā)利用備受關(guān)注。目前，人工代料栽培靈芝的培養(yǎng)基質(zhì)以木屑、棉籽殼為主，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，原材料成本一路攀升，尋求一種新的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)原料成為靈芝代料產(chǎn)業(yè)亟待解決的難題之一[4-5]。桑枝作為蠶桑產(chǎn)業(yè)中生物量最多的副產(chǎn)物，富含纖維素、粗蛋白、桑黃酮、生物堿等多種營養(yǎng)物質(zhì)和功能成分[6]，理論上可作為靈芝代料栽培的上等培養(yǎng)原料，也可使廢棄桑枝得到合理有效的利用。本試驗(yàn)以桑枝和棉籽殼為主要培養(yǎng)基，通過不同的配比栽培靈芝主栽菌株G1，并對其菌絲生長特性、農(nóng)藝性狀及子實(shí)體功能成分含量(包括靈芝多糖、黃酮及三萜類物質(zhì))進(jìn)行差異分析，以期獲得以桑枝為主要基質(zhì)高效栽培靈芝的最優(yōu)配方，為桑枝靈芝的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株。G1為赤芝(Ganoderma lucidum)，由湖南省蠶桑科學(xué)研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基。母種培養(yǎng)基(PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，KH2-PO43g，MgSO41.5g，酵母膏2g，蛋白胨2g，水1000ml，pH自然)，121℃、0.1MPa高壓蒸汽下滅菌后備用。

原種培養(yǎng)基(玉米粒74%，小米25%，石膏1%，pH自然)，121℃、0.1MPa高壓蒸汽下滅菌后備用。

1.1.3 主要試劑與儀器。馬鈴薯、玉米粒、棉籽殼、麥麩等購自本地農(nóng)貿(mào)市場，桑枝來源于湖南省蠶?？茖W(xué)研究所桑樹資源圃，葡萄糖、酵母膏、瓊脂、KH2PO4、MgSO4、蒽酮、硫酸、熊果酸、香蘭素、冰醋酸、高氯酸、蘆丁、甲醇、乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁等，試劑均為分析純。

YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),DH G-9140恒溫干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),SW-CJ-2FO凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),LRH-150生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),KA-1000型臺式離心機(jī)(日本日立公司),UV-1800型紫外可見分光光度儀(日本島津公司),其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母種活化與原種培養(yǎng)。按無菌化操作要求分別取黃豆粒大小G1靈芝母種的菌種，轉(zhuǎn)接于PDA母種培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)6d，取生長邊緣的旺盛菌絲再接種于新培養(yǎng)基內(nèi)，反復(fù)轉(zhuǎn)接至菌絲恢復(fù)生長活力，保存?zhèn)溆谩?/p>

在滅菌后備用的玉米粒原種培養(yǎng)基中依次接種，做好標(biāo)記，置25℃組培室中暗培養(yǎng)20 d左右，待菌絲長滿菌袋后保存在4℃冰箱備用。

1.2.2 栽培種的制作。將桑枝粉碎加工成直徑小于5mm的木屑顆粒，按照各種配方要求(詳見表1)與棉籽殼、麥麩等混合裝在規(guī)格為17cm×33cm的聚丙烯袋中，每袋干料0.5Kg，每個配方30袋，共3次重復(fù)，121℃、0.1MPa高壓蒸汽下滅菌2 h后備用。

表1 桑枝靈芝栽培基質(zhì)配方

1.2.3 發(fā)菌培養(yǎng)。把在無菌條件下接種的靈芝菌袋放置在25℃、相對濕度為60%～70%且通風(fēng)良好的組培室中進(jìn)行避光發(fā)菌，每天觀察菌絲的生長及污染情況，發(fā)現(xiàn)雜菌污染的菌包及時剔除，定期記錄靈芝菌絲生長速度、菌絲外觀、長勢及發(fā)菌時間等生長特性。

1.2.4 出芝管理。待菌絲長滿菌袋后，表面菌絲由白色逐漸轉(zhuǎn)為乳白或淺黃色，便開始揭蓋進(jìn)行出芝管理。培養(yǎng)溫度嚴(yán)格控制在25℃～30℃，定時通風(fēng)，現(xiàn)蕾期的空氣濕度為80%～90%，在菌蓋分化期啟用加濕器保持恒定空氣相對濕度85%～90%。當(dāng)菌蓋邊緣白色生長線消失、子實(shí)體長成，開始及時采收。出芝期間觀察并記錄各配方各重復(fù)子實(shí)體的農(nóng)藝性狀，包括現(xiàn)蕾時間、菌蓋直徑厚度、菌柄長度、孢子彈射量，并計算單袋平均產(chǎn)量及生物學(xué)轉(zhuǎn)化率。

1.2.5 靈芝子實(shí)體活性物質(zhì)含量的測定。子實(shí)體中靈芝多糖的提取與檢測，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.579x+0.077測定多糖含量[7]；靈芝三萜的提取與檢測，以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.510x-0.005測定總?cè)坪縖8]；子實(shí)體中黃酮的提取與檢測，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.319x+0.047測定總黃酮的含量[9]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行初步統(tǒng)計，用SPASS 18.0統(tǒng)計處理軟件進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方對靈芝菌絲生長特性的影響

在培養(yǎng)條件一致的情況下，不同的配方對靈芝菌株G1的菌絲生長情況影響較大(見表2)。在配方4中(CK)的純棉籽殼培養(yǎng)基中，靈芝菌絲的生長速度最快，為4.17±0.29 mm/d，且長勢良好，表明棉籽殼的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)及C/N比較適合靈芝菌絲的生長發(fā)育；而在添加了50%桑枝木屑的配方2中，菌絲生長速度也高達(dá)4.02±0.34 mm/d，僅次于對照組，無顯著差異，且菌絲外觀濃密、潔白、長勢旺盛，從菌絲表現(xiàn)來看也可以作為菌株G1的最優(yōu)配方。菌絲生長速度較慢的是配方1和配方3，平均生長速度都在4.0 mm/d以下，與對照組差異顯著，且菌絲長勢一般。從表2可知，菌絲生長情況并沒有隨著桑枝木屑添加量的增加而逐漸減弱，反而在配方2中達(dá)到最優(yōu)，分析其中的原因可能是雖然桑枝沒有棉籽殼內(nèi)的營養(yǎng)成分和C/N比合適，但靈芝為好氣性真菌，一定量的桑枝木屑可以增加袋內(nèi)的空氣流動，促進(jìn)了菌絲生長，而當(dāng)桑枝木屑添加過多(配方1)難以給靈芝菌絲提供充足的養(yǎng)分，導(dǎo)致其生長緩慢、菌絲稀疏、不整齊等外觀表現(xiàn)。

表2 不同配方靈芝菌絲生長情況

注：同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同者表示P<0.05水平的差異顯著性，下同。表中“++”表示長勢較弱，“+++”表示長勢中等，“++++”表示長勢旺盛。

2.2 不同配方對靈芝子實(shí)體農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響

在不同比例桑枝添加量的培養(yǎng)基質(zhì)中，靈芝子實(shí)體的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量等各項(xiàng)生長指標(biāo)存在一定差異(見表3)。在菌絲長滿并開口后，配方2培養(yǎng)基中的靈芝現(xiàn)蕾最早，平均6d可完成現(xiàn)蕾，比對照組早1d；在配方1、配方2、配方3之間，在菌蓋直徑、菌蓋厚度和孢子粉彈射量的指標(biāo)上存在顯著差異(P<0.05)，其中，配方2的這3項(xiàng)性狀指標(biāo)(菌蓋直徑11.58±0.65cm，厚度1.63±0.15mm，彈孢量4.28±0.36g)優(yōu)于其它配方，僅次于對照組，表現(xiàn)突出，理論上靈芝孢子粉的彈射量隨著菌蓋直徑及厚度的增大而增加，從表中數(shù)據(jù)可以看出，該試驗(yàn)結(jié)果符合一般規(guī)律；但在短柄靈芝品種G1的菌柄長度上，配方1和配方2的表現(xiàn)優(yōu)于配方3和對照，其中各項(xiàng)生長指標(biāo)均較弱的配方1培養(yǎng)的靈芝子實(shí)體菌柄最長，為3.56±0.24cm；以配方2培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝子實(shí)體鮮重為123.95±5.58g，與對照配方靈芝無顯著差異，在配方1培養(yǎng)基中生長的靈芝子實(shí)體鮮重最低，只有85.66±5.36g；生物轉(zhuǎn)化率與子實(shí)體鮮重產(chǎn)量是呈正相關(guān)的，其順序依次為：配方1<配方3<配方2

2.3 不同配方對子實(shí)體活性成分的影響

多糖、三萜和黃酮作為靈芝的主要活性物質(zhì)，其含量是衡量靈芝品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，同一個菌株的活性成分含量由于基質(zhì)配方、培養(yǎng)條件、環(huán)境或培管方法不同而存在差異。分別對上述4種不同配方的靈芝子實(shí)體進(jìn)行活性成分的檢測(見表4)可知，添加桑枝木屑的配方靈芝比CK組靈芝的所測活性成分含量明顯提高，除了靈芝三萜外，多糖和黃酮含量隨著桑枝木屑的比例增加呈現(xiàn)一定的上升趨勢，表明桑枝作為一種培養(yǎng)基質(zhì)有利于靈芝子實(shí)體的次生代謝產(chǎn)物的分泌合成，起到一定的誘導(dǎo)作用，其中，配方2中的靈芝三萜及黃酮含量達(dá)到最高，分別為4.71±0.42 mg/g和0.43±0.09 mg/g，與其他配方存在顯著差異，而在靈芝多糖的含量上，配方1的多糖含量最高，為0.63±0.04 mg/g，配方2中靈芝多糖僅次于配方1，無顯著差異。因此在活性成分的比較上，可選擇配方2為靈芝菌株G1的最佳配方。此外從表4可知，該菌株的三萜含量明顯高于多糖和黃酮類物質(zhì)，CK組的靈芝三萜也高達(dá)2.44±0.87 mg/g，出現(xiàn)這一結(jié)果應(yīng)該與品種特性有關(guān)，在應(yīng)用上可將菌株G1作為獲得高劑量靈芝三萜的加工專用型菌種。

圖1 不同配方的靈芝活性成分含量

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)以桑枝和棉籽殼為主要培養(yǎng)基，通過不同的配比培育靈芝主栽菌株G1，對其菌絲生長特性、農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量及子實(shí)體活性成分含量(包括靈芝多糖、黃酮及三萜類物質(zhì))等指標(biāo)進(jìn)行差異分析，結(jié)果表明添加50%桑枝木屑、30%棉籽売、15%麥麩的配方是適宜靈芝主栽菌株G1優(yōu)質(zhì)高效栽培的最優(yōu)配方。

通過本試驗(yàn)篩選了以桑枝木屑為主要基質(zhì)適宜靈芝主栽菌株G1栽培的最優(yōu)配方，以桑枝木屑為主要基質(zhì)培育其它靈芝主栽菌株的最優(yōu)配方需要在以后的試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。