閆彩燕 ，鄒奕 ，吳則東 ，興旺 ，李紅俠 *

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

甜菜原產(chǎn)于地中海沿岸，是世界上第二大糖源作物，僅次于甘蔗。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜育種中的廣泛應(yīng)用，目前甜菜的基因組全序列測(cè)定工作已經(jīng)完成[1]，為甜菜的遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因甜菜培育等工作打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)[2－8]。而這些實(shí)驗(yàn)都需要大批量的DNA，因此如何快速高效地提取DNA成為了提高實(shí)驗(yàn)效率的關(guān)鍵，用傳統(tǒng)方法大規(guī)模提取DNA費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜等問(wèn)題日益突出，因此尋找一種適用于甜菜大規(guī)?？焖偬崛NA的方法十分重要。目前關(guān)于各種植物DNA提取方法嘗試的報(bào)道已有很多，近期的如Biswas等[9]嘗試了一種不使用液氮進(jìn)行植物DNA提取的方法；Dang等[10]報(bào)道了一種能從花生和其他含油種子中快速提取DNA和RNA的方法；Takakura等[11]報(bào)道了一種利用蔗糖緩沖液和玻璃纖維過(guò)濾器從植物組織中提取DNA的方法；Shi等[12]報(bào)道了一種使用濾紙、96孔板和自制無(wú)毒緩沖液相結(jié)合的高通量提取植物DNA的方法；李委等[13]報(bào)道了一種適用于辣椒的DNA快速提取技術(shù)；芮文婧等[14]報(bào)道了一種改進(jìn)的番茄葉片DNA提取方法并優(yōu)化了SSR反應(yīng)體系。目前實(shí)驗(yàn)室常用的傳統(tǒng)DNA提取方法為使用液氮冷凍樣品然后進(jìn)行研缽研磨，但這種方法提取的效率較低，研缽研磨較慢，而且樣品容易損失，難以適應(yīng)大批量DNA提取的需求。因此對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，一種快速高效低成本的大批量植物DNA提取方法十分必要。經(jīng)我們的實(shí)驗(yàn)證明利用液氮處理和震蕩研磨機(jī)相結(jié)合可以快速高效地提取甜菜基因組DNA，提高甜菜分子標(biāo)記輔助育種和遺傳多樣性分析的效率。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中所用到的甜菜樣本均來(lái)自于中國(guó)農(nóng)科院甜菜研究所試驗(yàn)田田間取樣，共取兩個(gè)甜菜品種：BETA176、MA3001，每個(gè)品種取24個(gè)個(gè)體，共48個(gè)樣本。

在田中取樣時(shí)，取號(hào)的鮮樣直接裝入事先已放好一枚7 mm小鋼珠的2 mL離心管中。裝樣之后馬上將離心管放入放有多個(gè)冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室后，馬上放入－80℃冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取方法 將裝有樣品的離心管從－80℃冰箱中取出，馬上放入到液氮當(dāng)中，待液氮不再發(fā)出聲音之后，迅速放到研磨機(jī)中以30次/s的振蕩頻率振蕩2 min；振蕩之后加入800 μL CTAB緩沖液，使用金屬浴65℃干浴1 h之后置于冰箱保鮮層冷卻至15℃以下；加入400 μL 24∶1的氯仿/異戊醇，上下混勻后放置5 min以上，之后使用高速離心機(jī)12 000 r/min離心10 min；取上清液400 μL，裝入新的離心管中，加入400 μL異丙醇，上下混勻；放入冰箱保鮮層靜置30 min以上；使用高速離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液；使用70%乙醇潤(rùn)洗后，放于室溫下待乙醇揮發(fā)干凈，加入100 μL TE緩沖液溶解DNA。

1.2.2 基因組DNA檢測(cè) 本次實(shí)驗(yàn)中，我們使用微量分光光度計(jì)和SSR分子標(biāo)記兩種方法檢測(cè)。微量分光光度計(jì)只需1 μL DNA原液即可檢測(cè)出DNA濃度和OD260/280比值。SSR分子標(biāo)記檢測(cè)時(shí)，將所得DNA原液稀釋為10 ng/μL后，使用兩種INDEL引物擴(kuò)增，PCR體系和程序來(lái)自于文獻(xiàn)[15]，檢測(cè)方法采用銀染法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣品DNA的濃度和OD260/280，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果證明使用該方法提取出的DNA濃度較高，OD260/280的比值在1.84～2.02之間，純度較好，達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

2.2 INDEL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

利用兩個(gè)INDEL引物對(duì)兩個(gè)品種共48個(gè)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后使用濃度為8%的PAGE膠進(jìn)行快速銀染，所得結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。從圖1、圖2可知，該種新的DNA提取方法所得DNA可用于甜菜INDEL分子標(biāo)記。

表1 樣品DNA紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

圖1 引物ND75對(duì)甜菜樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物ND229對(duì)甜菜樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論

文中所述的甜菜DNA提取方法主要改進(jìn)之處在于使用振蕩研磨機(jī)和鋼珠代替了手工研磨缽研磨，將甜菜樣品直接放于離心管中，研磨后直接加入CTAB，減少了樣品的損失。極大地節(jié)省了人力和時(shí)間，提高了整個(gè)實(shí)驗(yàn)約30%的效率，并且所得DNA在濃度與純度檢測(cè)和PCR擴(kuò)增中表現(xiàn)良好。因?yàn)橛绊慏NA提取效果的兩個(gè)主要因素為樣品研磨是否精細(xì)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融[17]。本方法利用振蕩研磨機(jī)的高速振蕩和鋼珠的配合可保證樣品研磨的精細(xì)度，同時(shí)也最大程度地避免了樣品的反復(fù)凍融。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，大規(guī)模多數(shù)量的DNA提取已成為實(shí)驗(yàn)室常態(tài)，在這種情況下，本方法可為植物基因組DNA的提取提供一種新的思路和途徑。