摘 要：調(diào)查中山市某菜市場生鮮畜禽肉中變形桿菌的污染情況，分析占優(yōu)勢的奇異變形桿菌的親緣關(guān)系。采集268 份生鮮畜禽肉樣品，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測和生化實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)污染的變形桿菌進(jìn)行分離鑒定，并利用腸桿菌基因間保守重復(fù)共同系列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）技術(shù)對(duì)分離的奇異變形桿菌進(jìn)行分子分型及同源性分析。結(jié)果表明：所有類型的樣品受變形桿菌污染嚴(yán)重，程度由大到小依次為雞肉、鴨肉和豬肉；PCR與生化鑒定結(jié)果一致，共檢出123 株變形桿菌，變形桿菌陽性攜帶率為51.6%，其中117 株為奇異變形桿菌；ERIC-PCR指紋圖譜條帶均為3～9 條，呈現(xiàn)良好的多態(tài)性；101 株奇異變形桿菌集中分布在E、I、K簇，簇內(nèi)相似性大于70%。ERIC-PCR技術(shù)適用于奇異變形桿菌的分型及同源性研究，對(duì)變形桿菌引起的食品污染和親緣性溯源具有重要意義。

關(guān)鍵詞：鮮肉；變形桿菌；桿菌基因間保守重復(fù)共同系列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分型；親緣性溯源

Contamination and Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction Typing of

Proteus on Fresh Livestock and Poultry Meats in Zhongshan City

CHEN Shanjiao1，2， SUN Lengning1，2， CHEN Shaowan1， WANG Zongyuan1， BI Shuilian1，*

（1.School of Public Health， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；

2.School of Food Science， Guangdong Pharmaceutical University， Zhongshan 528458， China）

Abstract： The purpose of this study was to investigate the Proteus contamination on fresh livestock and poultry meats from a local farmers market Zhongshan， Guangdong province and to analyze the genetic relationship of the dominant Proteus mirabilis. A total of 268 samples of fresh livestock and poultry meats were randomly collected. The Proteus contaminating meat samples were detected by polymerase chain reaction （PCR） and biochemical assays， and then the molecular typing and homology of P. mirabilis isolated were analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus （ERIC）-PCR. The results showed that all types of samples were heavily contaminated with Proteus， ranging from severe to moderate in the decreasing order of chicken， duck and pork. Furthermore， the results of PCR and biochemical identification were consistent. Among the 123 strains of Proteus isolated， 117 were P. mirabilis， with a positive rate of 51.6%. ERIC-PCR genotyping exhibited 3?9 bands for each P. mirabilis isolate， suggesting a good polymorphism. A total of 101 strains of P. mirabilis belonged to the E， I and K clusters， with greater than 70% intra-cluster similarity. ERIC-PCR is suitable for the typing and homology analysis of P. mirabilis， and it is of great significance to evaluate food contamination by Proteus and its traceability.

Keywords： fresh meat； Proteus； enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction； genotyping； genetic traceability

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807003

中圖分類號(hào)：TS251.55 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）07-0013-05

引文格式：

陳善嬌， 孫冷寧， 陳少婉， 等. 中山市生鮮畜禽肉中變形桿菌的污染分布及ERIC-PCR分型研究[J]. 肉類研究， 2018， 32（7）： 13-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807003. http：//www.rlyj.pub

CHEN Shanjiao， SUN Lengning， CHEN Shaowan， et al. Contamination and enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction typing of Proteus on fresh livestock and poultry meats in zhongshan city[J]. Meat Research， 2018， 32（7）： 13-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807003. http：//www.rlyj.pub

變形桿菌廣泛分布于自然界，為食源性條件致病菌，營養(yǎng)要求不高，一般可在食物上生長繁殖。由于變形桿菌引起的食物變質(zhì)通常無法通過肉眼直接觀察到，所以其很容易被忽視[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查表明，變形桿菌引起的食物中毒在我國十分常見，大多由奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）和普通變形桿菌（Proteus vulgaris）引起[3]。近年來，變形桿菌食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占有較大比重，并呈逐年上升趨勢，引發(fā)食物中毒的P. mirabilis也逐漸呈現(xiàn)多樣性變化的趨勢，主要以污染肉類為主，其中豬肉、雞肉和鴨肉的污染率相對(duì)最高，已經(jīng)引起人們的高度重視[4]。腸桿菌基因間保守重復(fù)共同系列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）技術(shù)是一種半隨機(jī)性質(zhì)的PCR技術(shù)，可以擴(kuò)增出反映微生物基因組結(jié)構(gòu)特征的產(chǎn)物，電泳圖譜重復(fù)性好，DNA模板制備簡單，不需復(fù)雜的儀器設(shè)備，省時(shí)且成本較低，常應(yīng)用于細(xì)菌分型以及菌株間親緣關(guān)系鑒定研究，但國內(nèi)文獻(xiàn)中將其用于變形桿菌的分型研究鮮有報(bào)道[5]。

本研究對(duì)中山市某肉菜市場中出售鮮肉中的變形桿菌進(jìn)行分離鑒定，并利用ERIC-PCR方法對(duì)分離所得

P. mirabilis菌株進(jìn)行分子分型，以了解變形桿菌的污染情況、分布規(guī)律及菌株間的親緣關(guān)系，旨在為變形桿菌引起食物中毒的溯源和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LB培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；蛋白胨、Taq DNA聚合酶、脫氧三磷酸核苷（dNTPs）、反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer，含Mg2+）、上樣緩沖液 寶生物工程（大連）有限公司；DL2000 DNA Marker 廣州東盛生物科技有限公司；GoldView核酸染料 北京賽百盛生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CTG16-WS高速離心機(jī) 湖南湘儀公司；ETc811 PCR擴(kuò)增儀 蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；T2A凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac Basic電泳儀 美國Bio-Rad

公司；VOSHIN-400R拍打儀 無錫沃信儀器有限公司；D1008E恒溫金屬浴 上海恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與前處理

2016年8—9月，從中山市某菜市場出售的生鮮肉中進(jìn)行隨機(jī)采樣，共采集包括雞肉122 份、鴨肉39 份、豬肉107 份在內(nèi)的樣品共268 份。采用無菌操作切取約20 g樣品放入無菌樣品袋，加入20 mL 0.1%無菌蛋白胨水后，于拍打儀中拍打1 min，取1 mL拍打液備用。

1.3.2 變形桿菌的分離培養(yǎng)與生化鑒定

將1 mL拍打液加入到4 mL腦心浸液增菌培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h后，取一接種環(huán)培養(yǎng)液在SS選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑選2～3 個(gè)可疑單菌落接種于LB培養(yǎng)基，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行三糖鐵、尿素、苯丙氨酸酶、檸檬酸鹽、硫化氫、鳥氨酸脫羧酶、明膠酶、脂酶、甘露糖、靛基質(zhì)、麥芽糖、木糖、水楊苷及七葉苷生化實(shí)驗(yàn)。每份樣品最多只保留1 株陽性菌。

1.3.3 基因組DNA的提取

取上述可疑單菌落增菌液1.5 mL至Eppendorf管中，12 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清液，加入500 μL已滅菌的超純水反復(fù)抽吸洗滌；12 000 r/min條件下離心3 min，棄去上清液，再加入200 μL無菌超純水反復(fù)抽吸，使細(xì)菌充分懸??；在金屬浴上100 ℃煮沸20 min后，12 000 r/min條件下離心5 min，取上清液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 變形桿菌的PCR鑒定

采用畢水蓮等[6]檢測變形桿菌的PCR方法對(duì)可疑菌株DNA進(jìn)行PCR鑒定，使用的PCR引物為SL/PF2（5-GTATCAT-GAACGTTCTGGGTAC-3）和SL/PR2（5-TGAAGTGATACGCTCTTGCAG-3），預(yù)期擴(kuò)增的目的片斷大小為596 bp。

1.3.5 ERIC-PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測

ERIC-PCR分型引物為ERIC1（5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3）和ERIC2（5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3）[7]。

反應(yīng)體系為20 μL，其中Taq DNA聚合酶0.1 μL、10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs（10 mmol/L） 0.4 μL、引物ERIC-F、ERIC-R（10 μmol/L）1 μL、DNA 2 μL、無菌超純水13.5 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃、5 min預(yù)變性，94 ℃、30 s復(fù)性，44 ℃、1 min退火，72 ℃、3 min延伸，循環(huán)35 次，72 ℃、10 min終延伸。

產(chǎn)物檢測：在1.5%瓊脂糖凝膠中加入GoldView核酸染料，使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%，每孔加入8 μL PCR產(chǎn)物，50 V電泳90 min后取出，在凝膠成像儀中拍照并觀察結(jié)果。

1.3.6 ERIC-PCR分型聚類結(jié)果分析

采用Quantity One軟件對(duì)分離所得P. mirabilis的指紋圖譜進(jìn)行分析，運(yùn)用Shannon-Wiener指數(shù)分析圖譜的多樣性，其計(jì)算公式為H=-∑Piln（Pi）（式中Pi=

Ni/N，Ni代表樣品的第i條ERIC條帶的峰下面積，N為此樣品ERIC所有條帶的峰下面積）[8]，由系統(tǒng)依據(jù)Cluster method自動(dòng)計(jì)算條帶的相似性，并采用分析法繪制出系統(tǒng)樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生鮮畜禽肉中變形桿菌的污染情況

對(duì)268 份生鮮畜禽肉樣品中分離得到的可疑菌株進(jìn)行PCR鑒定和生化實(shí)驗(yàn)。由表1可知，123 份樣品污染了變形桿菌，變形桿菌陽性率為45.9%。生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致，并且污染的123 株變形桿菌中117 株為P. mirabilis，占95.1%，其余6 株為P. vulgaris，占4.9%。變形桿菌污染率最高的樣品為雞肉，其次為鴨肉，最低的為豬肉，污染率分別為52.5%、51.3%和36.4%。

2.2 ERIC-PCR分型聚類結(jié)果

采用ERIC-PCR方法對(duì)117 株P(guān). mirabilis進(jìn)行分子分型，得到了較好的分型結(jié)果。所有P. mirabilis的電泳條帶清晰可見，大小均在250～3 000 bp之間，條帶個(gè)數(shù)為3～9 條。

由圖1可知，117 株P(guān). mirabilis菌株具有較高的遺傳差異性和分辨率，分辨率系數(shù)為0.95，117 株P(guān). mirabilis菌株呈現(xiàn)117 種不同的指紋圖譜，以相似性70%為界限，可分成A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11 個(gè)不同的亞類，相似系數(shù)為0.45～1.00。A、B、D、F、H簇均只包含1 株菌株，C、G、J簇分別包含2、6、3 株

P. mirabilis，其他所有菌株（101 株，占86.3%）均集中分布在E、I、K簇中，分別包含18、33、50 株菌株。E、G、K簇P. mirabilis來源于雞肉、豬肉和鴨肉樣品，而C、I、J簇P. mirabilis均僅分離自雞肉和豬肉樣品。

通常相似性大于或等于90%的菌株被認(rèn)為是起源相同的分離株，即為同一個(gè)基因型[9]。由圖1可知，菌株11AD7a與11AD6a的相似性為0.94，11AD9a與11AD8a的相似性為0.93，11AD20a與11AD19b的相似性為0.92，11AC55a與11AC31a的相似性為0.91，11AC51a和11AC50a的相似性為0.90，11AC45a與11AC39a的相似性為0.95，這些分離株之間可以認(rèn)為是同一個(gè)基因型，且均來源于相同類型的樣品（前3 組菌株均來源于鴨肉，后3 組均來源于雞肉）。菌株11AD18a和11AC47a的相似性為0.94，11AC60a與11AP1b的相似性為0.90，11AP46b、11AD11a與11AP12b的相似性為0.91，11AD3a與11AP50a的相似性為0.95，這4 組同一基因型的菌株采樣時(shí)間相隔比較近，均相隔2～3 d。

3 討 論

對(duì)食源性致病菌進(jìn)行分子分型已經(jīng)成為食品污染調(diào)查和分子流行病學(xué)分析中重要的技術(shù)手段。脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）分型是公認(rèn)的分子分型方法中的金標(biāo)準(zhǔn)[10]，該方法具有分辨率高[11]、

穩(wěn)定性和重復(fù)性好[12]、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)[13]，但操作復(fù)雜、耗時(shí)長、試劑耗材成本高且需要專門的儀器和技術(shù)人員在一定程度上限制了PFGE技術(shù)的應(yīng)用。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multilocus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）[14-15]、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）[16-17]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）[18]、基于重復(fù)元素的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive element-based polymerase chain reaction，REP-PCR）[19]、

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[20]及ERIC-PCR等方法已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分型[21]。但是前2 種方法均存在一定的缺點(diǎn)，如MLVA的重復(fù)性受位點(diǎn)本身的特點(diǎn)和使用片段長度檢測方法的影響較大，不同實(shí)驗(yàn)室間的可比性較差，不易于標(biāo)準(zhǔn)化；MLST的成本高，需要特定儀器，用于某些病原菌分型時(shí)分辨率低，對(duì)不同地區(qū)暴發(fā)和沒有直接流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的菌株分型能力差。ERIC-PCR分型技術(shù)不需已知核酸序列[22]、簡便快速、成本低、重復(fù)性好、靈敏度高[23]、結(jié)果準(zhǔn)確[24]，已廣泛應(yīng)用于志賀菌[25]、大腸桿菌[26]、沙門氏菌[27]和空腸彎曲菌[28]等許多食物中毒病原菌的分型，本研究也將ERIC-PCR技術(shù)成功應(yīng)用于

P. mirabilis的快速分型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)中山市生鮮畜禽肉中污染的P. mirabilis的親緣性分析。

P. mirabilis和P. vulgaris是變形桿菌污染食品中最常見的2 個(gè)類型，其中變形桿菌引起的感染性疾病90%以上都是由P. mirabilis引起[29]。本研究中污染樣品中的變形桿菌95.1%為P. mirabilis，4.9%為P. vulgaris，未檢測到其他變形桿菌。

變形桿菌在食品中的檢出率一般為11.3%～60.0%，其檢出率會(huì)因氣溫的變化而呈現(xiàn)差異。天氣炎熱時(shí)，細(xì)菌更容易生長繁殖，變形桿菌的分離率會(huì)偏高[30]，因此，氣溫普遍較高的夏季也是變形桿菌食物中毒爆發(fā)的高峰期。本研究的采樣時(shí)間為8—9月，此段時(shí)間中山市氣溫很高，豬肉、鴨肉和雞肉中變形桿菌污染嚴(yán)重，污染率為36.4%～52.5%。

變形桿菌為條件致病菌，只有當(dāng)食品中繁殖的活菌量超過104 CFU/g時(shí)才可能引發(fā)食物中毒[31]，因此，在判斷由變形桿菌引發(fā)的食物中毒時(shí)，還需檢測變形桿菌的活菌量作為參考。鮮肉中存在2 種及以上變形桿菌污染或變形桿菌與大腸桿菌、沙門氏菌等其他細(xì)菌同時(shí)污染的情形，提示銷售商在銷售鮮肉的過程中務(wù)必要注意分開銷售，避免交叉污染。

4 結(jié) 論

中山市某菜市場生鮮畜禽肉中污染的變形桿菌主要為P. mirabilis，污染率高達(dá)51.6%，其中雞肉污染最嚴(yán)重，鴨肉次之，豬肉相對(duì)最低。P. mirabilis菌株分布呈現(xiàn)多態(tài)性和一定的規(guī)律性，相近日期采集的樣品中分離的P. mirabilis相似性更高，來源相同的樣品中

分離的P. mirabilis部分呈現(xiàn)相同的ERIC-PCR基因型。ERIC-PCR技術(shù)適用于P. mirabilis的分型及同源性研究，對(duì)變形桿菌引起的食物污染、食物中毒調(diào)查、親緣性溯源具有重要意義。

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