摘 要：通過鴨的肌動蛋白β-actin保守基因設(shè)計可特異檢測鴨肉成分的引物和探針，建立實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測鴨肉的方法，并通過模擬肉樣和市售樣品檢測方法的準確性和適用性。結(jié)果表明：該方法可以特異性檢測出麻鴨和草鴨成分，而對豬、牛、羊、雞等DNA均沒有擴增，檢測靈敏度可達到1 pg DNA;通過模擬肉樣檢測確定最低質(zhì)量分數(shù)檢測限為0.01%;市售樣品的檢測結(jié)果表明，該方法能很好地應(yīng)用于市場，滿足市場檢測需求。

關(guān)鍵詞：實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng);鴨肉;靈敏度;檢測限

Detection of Duck-Derived Ingredients in Meat Products by Real-time Fluorescent Polymerase Chain Reaction

ZHANG Xiuping1， MIAO Li2，*

（1.Identification Consulting Center of Henan Inspection and Quarantine， Zhengzhou 450003， China;

2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Zhengzhou 450003， China）

Abstract： According to the conserved sequence of the duck β-actin gene， specific primers and probes were designed， and a real-time polymerase chain reaction （PCR） assay was developed for detecting duck-derived ingredients in meat products. Its accuracy and applicability were evaluated using model and commercial meat samples. Results showed that this method could specifically detect duck-derived ingredients and could not amplify porcine， bovine， ovine and chicken DNA. Its limit of detection was 1 pg of DNA. The minimum detectable level was 0.01% for model meat samples. The results obtained from detection of commercial meat samples showed that this method can meet the requirements for the requirements for the detection of duck-derived components in meat products.

Keywords： real-time fluorescent polymerase chain reaction; duck; sensitivity; detection limit

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807007

中圖分類號：TS207.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）07-0037-05

引文格式：

食品的質(zhì)量和安全問題日益成為社會關(guān)注的焦點，隨著人們生活水平的提高，肉制品消費已經(jīng)成為食品消費的重要組成[1-3]，而目前利用摻雜摻假、以次充好等手段制造“假羊肉”、“假牛肉”事件屢屢出現(xiàn)[4]。檢驗檢疫部門有必要加強對于肉及肉制品的檢測，以確保國內(nèi)消費者的權(quán)益得到保護。

在食品中動物源性成分鑒定方面，實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)憑借其高度靈敏性和特異性，已逐步成為肉類成分鑒別的重要技術(shù)[5-7]。楊麗霞等[8]根據(jù)鴨線粒體基因序列的位點差異設(shè)計特異性引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，通過溶解曲線分析，建立熒光定量PCR檢測方法。史艷宇等[9]以鴨線粒體基因全序列為靶位點設(shè)計引物和探針，建立鴨源性成分檢測方法，檢測靈敏度可達0.1 μg/kg。

β-actin基因是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，具有基因序列高保守性，并且在不同組織間可以穩(wěn)定表達[10-12]。當(dāng)前研究中多選用線粒體基因，線粒體DNA由于豐度高且在不同組織部位的含量不一致，容易導(dǎo)致定量結(jié)果偏差較大，而β-actin基因作為單拷貝基因，具有基因序列高保守性，在肉源性成分定性及定量方面具有重要參考價值。

本研究通過從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找序列并設(shè)計鴨特異的PCR引物和探針，建立快速、準確的實時熒光PCR技術(shù)檢測方法，為食品市場檢測構(gòu)建技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉以及鴨肉制品

鄭州市某農(nóng)貿(mào)市場;蛋白酶K（20 mg/mL） 日本TaKaRa公司;Tris-飽和酚、氯仿-異戊醇（24∶1） 北京

索萊寶生物科技有限公司;組織裂解液（1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS））、75%無水乙醇 自配;所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 7500熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;DT500電子天平 江蘇常熟長青儀器廠;Hermle Z36HK高速冷凍離心機 德國哈默公司;NTS-4000AM恒溫振蕩水槽 上海斯信有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用酚-氯仿法提取樣品的基因組DNA，具體步驟參考文獻[13-14]進行，最后加入100 μL TE緩沖液溶解DNA，然后采用核酸定量測定儀測定提取肉樣的DNA含量。

1.3.2 引物和探針設(shè)計

通過核酸比對軟件DnamaN對GenBank中公布的多個物種的β-actin基因共17 個序列進行比對，其中包括5 個鴨源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為EF667345.1、NM_001310421.1、GU564232.1、AY251275.1和DQ675572.1）、3 個雞源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為L08165.1、NM_205518.1和JF436880.1）、3 個豬源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為DQ452569.1、DQ845171.1和U07786.1）、3 個羊源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為NM_001009784.1、U39357.1和AF035422.1）、2 個牛源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為AY141970.1和BT030480.1）和1 個鵝源β-actin基因（GenBank中的登錄號為M26111.1），篩選出鴨β-actin基因的特異序列，并運用Primer 5.0軟件（加拿大Premier開發(fā)公司）設(shè)計鴨源性成分的特異性引物和探針。引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物和探針序列如表1所示。

1.3.3 熒光PCR反應(yīng)程序

反應(yīng)體系為25 μL：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL（反應(yīng)體系終濃度0.2 μmol/L）、探針1 μL（反應(yīng)體系終濃度

0.4 μmol/L）、DNA模板2 μL，其余用滅菌雙蒸水補齊。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，58 ℃、45 s;40 個循環(huán)。

1.3.4 引物與探針的特異性驗證

以從豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉中提取的DNA作為模板，進行實時熒光PCR反應(yīng)，以驗證所設(shè)計各引物和探針體系的特異性。

1.3.5 靈敏度實驗

提取純鴨肉粉DNA，調(diào)整DNA模板的初始質(zhì)量濃度為100 ng/μL，用滅菌雙蒸水分別進行10 倍倍比稀釋，然后分別取2 μL各稀釋度的稀釋液為模板，同時設(shè)置陰性對照，進行實時熒光PCR，檢測所設(shè)計引物、探針的靈敏度。

1.3.6 檢測下限的確定

取總質(zhì)量為10 g的肉粉，在雞肉基質(zhì)中添加質(zhì)量分數(shù)為0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的鴨肉粉，用研磨機進行混樣，得到梯度質(zhì)量分數(shù)的鴨肉粉樣品;稱取100 mg樣品進行DNA提取和熒光PCR擴增，根據(jù)實驗結(jié)果確定檢測下限。

1.3.7 市售樣品的檢測

為驗證該方法在實際樣品檢測中的可應(yīng)用性，購買市售的10 個生產(chǎn)廠家的鴨肉加工制品，運用本方法進行驗證，同時運用SN/T 3731.5—2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分 鴨成分檢測 PCR法》[15]中的方法進行驗證，比較實驗結(jié)果是否一致。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，利用Excel軟件進行圖表編輯，采用聯(lián)合國糧農(nóng)組織（United Nations Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）方法規(guī)定統(tǒng)一的檢測數(shù)據(jù)評價標準，即相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）≤25%。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與濃度測定

提取DNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.7～2.0之間，完全符合實時熒光PCR的要求。

2.2 特異性測定結(jié)果

由圖1可知，麻鴨和草鴨的DNA均有擴增，而豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉等其他物種的DNA均沒有擴增，表明鴨的引物和探針特異性良好，可以用于熒光PCR檢測。

2.3 靈敏度測定結(jié)果

分別利用麻鴨和草鴨的5 個質(zhì)量濃度梯度的DNA稀釋液（0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 ng/?L）為模板，對建立的實時熒光PCR檢測體系進行靈敏度實驗和可重復(fù)性分析。

由表2～3可知：當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.000 1 ng/?L時，在20 次擴增反應(yīng)中，麻鴨和草鴨陽性擴增次數(shù)分別為4 次和9 次，不滿足檢出率≥95%（即20 次擴增，陽性結(jié)果≥19 次）;當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.000 5 ng/?L時，在20 次擴增反應(yīng)中，所有鴨樣本均得到20 次陽性結(jié)果，滿足檢出率≥95%，且RSD≤25%，故鴨樣品可穩(wěn)定檢出的最低質(zhì)量濃度均為0.000 5 ng/?L，即最低DNA質(zhì)量濃度為1 pg DNA（模板量2 ?L）。

2.4 方法檢測限

由圖2和表4可知：當(dāng)雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)為0.01%時，3 次平行測定中均能夠檢出鴨源性成分，平均Ct值34.97;而當(dāng)雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)為0.001%時，平均Ct值38.18，數(shù)值較高，不利于判定，因此本方法檢測雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)檢出限為0.01%。

2.5 市售樣品的檢測

由圖3可知，6 份標識有鴨成分的加工品中能夠檢出鴨源性的為5 份，其中1 份未檢出麻鴨和草鴨成分，與標準檢測結(jié)果一致，表明市面上可能存在假冒的鴨肉產(chǎn)品。

3 討 論

動物產(chǎn)品的質(zhì)量安全涉及畜牧業(yè)的健康發(fā)展，其安全和質(zhì)量越來越受到公眾的關(guān)注，而傳統(tǒng)的依靠感官和經(jīng)驗鑒別的手段已經(jīng)不能滿足市場需求，建立準確、快速、有效的動物源性成分檢測方法是研究熱點[16-18]。

基于PCR和實時熒光PCR方法檢測飼料和肉制品中的動物源性成分已得到了較多關(guān)注和研究[19-20]。何瑋玲等[21]運用動物細胞色素b（cytochrome b，cytb）基因的差異性位點，建立了豬、牛、羊和雞的快速鑒別方法;陳冬等[22]運用牛線粒體12S rRNA基因設(shè)計通用引物，成功鑒別混合鮮牛肉及制品中的牛種來源，但是對于鴨源成分的檢測研究不多。曲莉等[23]采用改良鹽析法和柱層析法有效提取鴨肉的mtDNA，通過在GenBank中下載綠頭鴨線粒體cytb基因序列進行比對，設(shè)計檢測鴨源成分的引物，擴增產(chǎn)物大小為223 bp。SN/T 3731.5—2013以及楊滴等[24]的研究主要應(yīng)用普通PCR技術(shù)對鴨源性成分進行檢測，普通PCR技術(shù)費時費力，容易污染，逐步被熒光定量PCR方法取代[25-27]。因此，迫切需要建立新的鴨源性成分檢測方法及標準，以滿足實際檢測的需要。

動物特異性基因具有物種特異性，有望成為肉類成分定性檢測的良好靶點[28-30]。本研究根據(jù)羊、牛、豬、雞、鵝5 種動物肌動蛋白β-actin基因序列的位點差異設(shè)計鴨特異性引物和探針，進行熒光定量PCR擴增檢測。結(jié)果表明，所篩選的引物和探針只對鴨的DNA產(chǎn)生特異性擴增曲線，而與豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉10 種動物的DNA無擴增，特異性較好。通過對DNA梯度稀釋液進行測定顯示，該方法的重復(fù)性好，靈敏度可低至1 pg，避免了因提取過程中DNA含量過低而出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。而在實際檢測中，肉制品中鴨源成分的質(zhì)量分數(shù)更能接近市場需求，因此，本研究通過制作模擬肉樣，確定了最低檢出質(zhì)量分數(shù)，為我國肉制品市場的規(guī)范化和有序化管理提供了必要的技術(shù)支撐，對政府部門的監(jiān)督管理工作具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究利用鴨的β-actin基因保守序列，建立用于檢測鴨成分的實時熒光PCR方法。經(jīng)測試，建立的檢測方法特異性強、靈敏度高，方法檢測限為1 pg DNA和質(zhì)量分數(shù)0.01%，且具有良好的可重復(fù)性，能夠滿足日常檢測的需求。對于市售樣品的檢測結(jié)果表明，5 份標注含鴨成分的實際樣本中均能檢出鴨成分，有1 份包裝鹵鴨肉產(chǎn)品未檢出鴨成分，表明產(chǎn)品可能存在摻假現(xiàn)象。

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