文│美國農(nóng)業(yè)部動植物衛(wèi)生檢驗局獸醫(yī)處

譯校│張淼潔 張倩 翟新驗（中國動物疫病預(yù)防控制中心）

一、引言

A 宗旨。本文件概述了偽狂犬病國家監(jiān)測計劃的實施程序。該計劃的目標為強化監(jiān)測，包括快速檢測、證明無疫、監(jiān)控國際或國內(nèi)的偽狂犬病毒（PRV）來源。

本文件旨在闡明：滿足PRV監(jiān)測目標的必要程序；何時將疑似或潛在的偽狂犬病例提交至AVIC進行調(diào)查；什么是高風(fēng)險的豬群，應(yīng)在何時采集樣本；溝通原則；將樣本送至何地；樣本實驗室檢測指南；報告和記錄檢測樣本的必要信息；樣本提交指南。

B PRV說明。偽狂犬病也被稱為奧耶斯基氏病，是一種在經(jīng)濟上非常重要的豬病，首次出現(xiàn)于20世紀60年代末期。豬群是偽狂犬病病毒（PRV）的首要宿主和儲存宿主，因此，豬群也是主要的傳染源。除豬以外，感染PRV的其他物種通常會經(jīng)歷劇烈瘙癢，并會在48小時內(nèi)死亡。有時，在其他物種身上觀察到的唯一癥狀就是猝死。馬、鳥類和人類被認為能抵抗PRV感染。

美國農(nóng)業(yè)部（USDA）動植物衛(wèi)生檢驗局（APHIS）在20世紀70年代末和80年代初開始執(zhí)行根除PRV的計劃，并于2004年在商業(yè)豬中根除了PRV，但是非商業(yè)豬和野豬群中仍然存在PRV感染?？稍赑RV監(jiān)測計劃（附件H）中查閱與病理學(xué)、臨床癥狀、傳染病學(xué)、診斷及PRV監(jiān)測合理性相關(guān)的更多信息。

C 監(jiān)測計劃概覽。本計劃旨在確定被視為PRV傳染高風(fēng)險的豬群數(shù)量和診斷樣本。監(jiān)測目標為能夠快速檢測到進入商業(yè)豬群中的病毒。目標豬群包括：疑似偽狂犬病例的調(diào)查和診斷；提交至診斷實驗室的病豬組織的抗原檢測；提交至診斷實驗室的豬病例的隨機血清學(xué)檢測；被定義為高風(fēng)險豬群的血清學(xué)檢測；已知同野豬接觸豬群的血清學(xué)檢測；選擇性宰殺的屠宰場公豬、母豬的血清學(xué)檢測；市場動物的肌紅蛋白檢測；存在PRV的野豬。

上述監(jiān)測流程支持監(jiān)測計劃的目標。PRV監(jiān)測計劃（附件H）中列出了各個流程。下文列出了與每個采樣流程相關(guān)程序的一般方法。

（1）疑似PRV病例的調(diào)查與診斷。結(jié)合豬群歷史、臨床癥狀和診斷信息來完成對PRV感染的診斷。應(yīng)向AVIC以及州動物衛(wèi)生官（SAHO）或指定人員報告出現(xiàn)PRV癥狀的臨床病豬。

適合這一類別的疑似豬病例包括：高死亡率（接近100%）并伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織學(xué)病變，或很少觀察到的與PRV一致的病變；出現(xiàn)呼吸癥狀、繁殖障礙的母豬；出現(xiàn)呼吸癥狀的斷奶仔豬，伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀或死亡率上升等情況。

符合以上特征的所有豬群應(yīng)提交至各州的AVIC/SAHO（附件C）。

AVIC或指定人員將決定是否授權(quán)進行全面調(diào)查。若授權(quán)進行調(diào)查，且僅從農(nóng)場采集了血清，需將血清及偽狂犬病監(jiān)測數(shù)據(jù)表（附件D）提交至PRV國家動物衛(wèi)生實驗室網(wǎng)絡(luò)（NAHLN）實驗室。若同時采集了血清和組織，將樣本提交至國家獸醫(yī)局實驗室（NVSL）進行分析。應(yīng)在所有樣本上粘貼NVSL條形碼。關(guān)于開展調(diào)查的更多信息，請查閱VS Memo 580.4

注：第二部分：詳細的樣本收集程序中列出了為調(diào)查疫病而獲取條形碼和采集樣本的程序（圖1）。

◎圖1

（2）提交至診斷實驗室的病豬組織的檢測。本流程中除血清外，其他組織的檢測需在檢測驗證成功后進行。

本流程涉及由執(zhí)業(yè)獸醫(yī)提交至PRV NAHLN實驗室的任何發(fā)病豬。當(dāng)病例滿足以下條件時，扁桃體、大腦和肺的樣本可用于進行PRV抗原PCR檢測（一旦驗證），血清可用于PRV血清檢測：商業(yè)豬或繁殖期出現(xiàn)急性呼吸道癥狀或神經(jīng)癥狀的豬樣本；與母豬流產(chǎn)相關(guān)的樣本。

NAHLN實驗室應(yīng)使用所有檢測樣本上的NVSL條形碼。由于此類樣本由執(zhí)業(yè)獸醫(yī)提交，因此實驗室需在樣本上粘貼條形碼。檢測到PRV可疑或陽性PCR結(jié)果的NAHLN實驗室將樣本轉(zhuǎn)寄至NVSL進行確人。檢測血清的NAHLN實驗室應(yīng)遵照血液/血清檢測程序（附件E）。此外，若接收到非陰性樣本，實驗室應(yīng)按照附件G進行通報和響應(yīng)。

不要求VS或各州人員按照該流程收集樣本。此類樣本由執(zhí)業(yè)獸醫(yī)提交至NAHLN實驗室。

（3）提交至診斷實驗室的豬病例的血清檢測。本流程檢測執(zhí)業(yè)獸醫(yī)向PRV NAHLN實驗室提交的用于診斷或日常監(jiān)控疾?。ǔ齈RV外）的血清，不包括為了通過PRV血清學(xué)檢測來確認豬群移動資格或豬群認證而提交的樣本。若執(zhí)業(yè)獸醫(yī)指定進行PRV檢測，則該樣本不適用于本監(jiān)測，除非血清符合“提交至診斷實驗室的病豬組織的檢測”的監(jiān)測流程。

本流程可包括為進行豬群特征分析而提交的樣本，以及來自有臨床癥狀的豬群血清。對于每個養(yǎng)殖場所提交的樣本，最多檢測5個血清樣本。

需要按照計劃制定的比率對合格的提交樣本進行檢測。由于實驗室的樣本很多，PRV NAHLN實驗室需要按照檢測配額和規(guī)范（附件B）進行檢測。實驗室將遵照已確定的檢測程序（附件E）和通報原則（附件G）。實驗室也將在檢測過的每個血清樣本上粘貼NAHLN條形碼。

樣本提交信息和檢測結(jié)果將被記錄于PRV實驗室登記表（電子表格），并在每月5日提交，或由NAHLN協(xié)調(diào)員負責(zé)校對。若實驗室沒有需要匯報的數(shù)據(jù)，則需要向NAHLN協(xié)調(diào)員匯報沒有數(shù)據(jù)需要報告。將制定一個網(wǎng)頁信息采集系統(tǒng)來完善數(shù)據(jù)輸入，并實現(xiàn)數(shù)據(jù)輸入的自動化。

檢測樣本應(yīng)能夠在空間和時間上代表所有的提交樣本。該流程將檢測每次提交的不超過五個樣本。

（4）被定為高風(fēng)險豬群的血清檢測。AVIC、各州的獸醫(yī)或指定人員將檢查生物安全防護措施，并授權(quán)檢測可能將PRV從野生宿主轉(zhuǎn)移至商業(yè)豬的高風(fēng)險豬群。本項監(jiān)測的目標是快速確定商品豬行業(yè)中的疾病。因此，進行檢測的高風(fēng)險豬群可能對商品豬行業(yè)造成直接影響的豬群。

確定是否為高風(fēng)險且適合在本監(jiān)測流程中進行檢測的豬群，應(yīng)考慮以下因素：野豬的集中程度，以及其同設(shè)施的接近程度；該設(shè)施中的用于直接或間接跨州銷售的豬；已購得豬的感染風(fēng)險；能夠接觸到野豬的房屋/設(shè)施/管理（生物安全措施的有效性）等。

附件B（PRV高風(fēng)險豬群的監(jiān)測）中列出了因有大量商業(yè)豬群和野豬存在而需要額外重視的縣名清單。該清單僅為可能的高風(fēng)險區(qū)域的參考。各州應(yīng)檢測其認為有必要保護的豬群，或迅速找到各州商業(yè)豬群中的疾病。

高風(fēng)險豬群的例子包括：可通往戶外，且位于已知野豬群10英里（1英里≈1.609千米）內(nèi)的商業(yè)豬群；在野豬群狩獵俱樂部10英里范圍內(nèi)的商業(yè)豬群；提供展覽用豬，特別是跨州展覽的豬群，且該豬群接觸過野豬。

展覽用豬的檢測不屬于高風(fēng)險檢測，不屬于本監(jiān)測計劃。曾是野豬的受限制豬群，或同野豬雜交的豬群不屬于用于檢測的高風(fēng)險豬群。此類豬群被認為是野豬群的擴大部分。

可通過農(nóng)場現(xiàn)場檢測、市場檢測、高風(fēng)險垃圾飼養(yǎng)檢測、小型屠宰場檢測或其他必要方法收集高風(fēng)險豬群的檢測樣本。若農(nóng)場現(xiàn)場的取樣被確定為最合適的樣本收集方法，應(yīng)采用95/10程序（附件F）檢測豬群。可根據(jù)設(shè)施類型安排高風(fēng)險豬群的檢測時間：可通往戶外的豬群每兩年進行一次抽樣；完全圈養(yǎng)但沒有圍欄的豬群，或戶外飼養(yǎng)但擁有有效圍欄的豬群，每五年進行一次檢測；完全圈養(yǎng)、擁有適當(dāng)?shù)纳锇踩胧òㄓ行У膰鷻冢┑呢i群，則無需檢測。

請聯(lián)系地區(qū)傳染病學(xué)家確定抽樣的豬群數(shù)量和方法。樣本應(yīng)提交至PRV NAHLN實驗室（見附件A）。各州應(yīng)在提交樣本前聯(lián)系實驗室以確定其是否能夠檢測。

美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)場現(xiàn)場抽樣數(shù)據(jù)表必須同樣本一同運送，具體示例參見附件D。送至實驗室的樣本若無此數(shù)據(jù)表，則不得用于進行分析。每個提交的樣本上必須有獨立的條形碼。AVIC或指定人員負責(zé)記錄所需數(shù)據(jù)?？稍谝韵戮W(wǎng)站獲取當(dāng)前版本的數(shù)據(jù)表： http://www.aphis.usda.gov/animal_health/animal_dis_spec/swine/pseu_surv_proced_manual.shtml

（5）報告接觸野豬豬群的血清檢測。適合該檢測程序的豬來自可能跨州移動且接觸到或可能接觸到野豬的高風(fēng)險戶外商業(yè)豬群。本流程依賴于生產(chǎn)者或所有者的自愿報告。若生產(chǎn)者懷疑有野豬入侵，或觀察到其豬群中有野豬，可聯(lián)系相關(guān)部門報告野豬入侵。野豬的入侵包括直接接觸，或有證據(jù)證明野豬同圍欄線有接觸。

在接到報告后，AVIC、州獸醫(yī)或指定人員將同各自的地區(qū)傳染病學(xué)家討論面臨的情況，并根據(jù)需要確定是否適合進行檢測，或加強豬群監(jiān)控和監(jiān)測。發(fā)現(xiàn)疑似接觸后的一段時間后（考慮到血清轉(zhuǎn)陽時間）在農(nóng)場按照95/10的采樣程序現(xiàn)場采集血樣，用于血清檢測（附件F）。

上文中的“高風(fēng)險豬群的血清檢測”[檢測流程（4）]中說明了數(shù)據(jù)采集方法。在本流程中，應(yīng)直接觀察到或者高度懷疑豬群直接暴露于野豬。若報告暴露，則應(yīng)就采樣方法和樣本提交的實驗室咨詢地區(qū)傳染病學(xué)家。樣本應(yīng)提交至PRV NAHLN實驗室進行分析。

須填寫PRV農(nóng)場現(xiàn)場豬檢測數(shù)據(jù)表，并同貼有條形碼的樣本一起提交至NAHLN實驗室。送至實驗室的樣本若無此數(shù)據(jù)表，則不得用于分析。

（6）屠宰場選擇性宰殺母豬、公豬的血清檢測。適合檢測的豬為在選定的聯(lián)邦/州的屠宰場進行選擇性宰殺的母豬、公豬。

收集適用于監(jiān)測的選擇性宰殺的母豬-公豬樣本，并送至位于堪薩斯州和肯塔基州的USDA實驗室。對樣本進行分類和監(jiān)測，確保滿足計劃標準中現(xiàn)有的監(jiān)測要求。樣本收集減少程序可適用于某些屠宰場。此類程序?qū)⒏鶕?jù)屠宰場的特定情況而定，并在AVIC的幫助下實施。

（7）屠宰場肉豬肌紅蛋白的收集與檢測。在選定的屠宰場宰殺的市場豬適用于肌紅蛋白檢測。使用批準的肌紅蛋白檢測分析方法來處理和分析從具有代表性的確定批次的市場中收集的豬肉樣本。將由VS員工和/或合同人員為本流程收集樣本。收集人員將樣本送至指定的實驗室。

盡快將數(shù)據(jù)錄入到電子數(shù)據(jù)表中，并在每個季度提交至工作人員進行檢查和分析。

（8）野豬的采樣。野豬的PRV采樣可與傳統(tǒng)的豬瘟（CSF）檢測計劃相關(guān)聯(lián)以提高采樣效率。適合進行檢測的野豬包括在各州自由生長的野豬，野生動物處（WS）的生物學(xué)家在上述各州可進入公共和私有土地捕捉野豬，并對其進行取樣。疾病檢測通常會同經(jīng)營活動結(jié)合，如開展野豬損害管理；但是，州層面的監(jiān)測和監(jiān)控方法可能會根據(jù)當(dāng)?shù)貙＜业耐度攵兴煌?/p>

WS為CSF監(jiān)測計劃而收集樣本的可同樣用于PRV監(jiān)測，確定是否存在PRV。WS野生動物疾病生物學(xué)家為PRV檢測收集的樣本將按照WS野豬綜合疾病監(jiān)測程序手冊提交至由WS管理的實驗室，提交用于PRV監(jiān)測血清的WS人員應(yīng)填寫數(shù)據(jù)表（附件D），并同樣本一起提交。

若樣本采集地區(qū)此前的野豬檢測為陽性，則不再進行檢測，WS確定有必要的情況除外。檢測應(yīng)限制在此前為陰性或PRV未知狀態(tài)的地區(qū)樣本中，尤其是最近有野豬入侵和/或商業(yè)豬生產(chǎn)的地區(qū)。WS收集的野豬樣本不提交至NVSL進行確認檢測。

要求在各自州內(nèi)進行野豬取樣的AVIC應(yīng)咨詢WS。為PRV分析而由除WS外的任何人提交的樣本，或通過同WS的合作而提交的樣本將不再USDA計劃中進行分析。

二、詳細的樣本收集程序

本節(jié)講述如何在現(xiàn)場收集組織和血液樣本。為PRV監(jiān)測收集的大部分組織樣本將由執(zhí)業(yè)獸醫(yī)提交。

然而，若需要為疑似PRV病例的調(diào)查和診斷采集血樣或組織樣本，應(yīng)按照PRV監(jiān)測中組織樣本和血液樣本收集程序進行?？稍诒疚牡贗V節(jié)中查找提交樣本的詳細信息。

1.所需工具。從安樂死或死亡的動物（僅為病豬）上采集扁桃體和組織；刀（和/或解剖刀）和剪刀；鉗子；塑料取樣袋或螺旋頂塑料管；采集血清；離心機（若可能）；10～12毫升采血管或真空容器；從豬采集血液所需的針（大小可選）；帶盧爾鎖頂端的注射器；“雷管型”離心管；豬保定裝置；組織和血清采集所需的工具；記號筆（防污/防水）；圓珠筆；消毒儀器和洗手所需的加熱容器或桶；漂白劑（消毒劑）；紙巾；冰袋；裝污染的個人防護服的垃圾袋；提交樣本的郵件包裹。

2.PRV檢測所需的組織。若需要收集組織樣本，應(yīng)從以下新鮮組織中采樣用于PRV檢測：扁桃體；肺；大腦（若可能采集）；血液（裝滿紅蓋管）。對所有動物采集血液，僅對有臨床癥狀的豬（病豬）收集其他組織。各種組織應(yīng)存放在獨立的袋子或管子中，并貼上計劃批準的條形碼（若適用），立即冷凍或冷藏。

以下詳細信息闡述了如何采集扁桃體樣本。僅在VMO調(diào)查可能感染PRV的豬群時收集扁桃體，VMO將在進行調(diào)查時進行死后檢查。其他PRV監(jiān)測流程不進行扁桃體的收集與檢測。

移除扁桃體（死豬）（見圖2）：

◎圖2

（1）將豬以屈膝背臥位放置。

（2）從下巴附近開始，用刀尾部劃開皮膚，露出下頜間和鄰面頸部的組織。

（3）切割各個下頜骨中間部分的軟組織，延長到每側(cè)鄰近的下頜聯(lián)合，切斷與舌頭的連接處。

（4）切斷舌頭的連接處，從尾部拉出舌頭的頂端，暴露出硬腭和軟腭。腭扁桃體，即擁有大的內(nèi)側(cè)隔核的平兩葉結(jié)構(gòu)，位于軟腭的尾部（紅色箭頭）。切割的側(cè)面連接部位（橙色箭頭）以防止舌頭縮回。應(yīng)收集整個扁桃體（兩葉）。

（5）拉出舌頭，進一步暴露扁桃體和喉頭蓋。注意扁桃體有淺凹的外表，因為上皮細胞內(nèi)陷形成腺窩。

（6）用剪刀從后部結(jié)構(gòu)的尾部分離扁桃體。

（7）用鑷子夾住扁桃體的尾部，用剪刀切下扁桃體伸出的連接部分。

（8）切割扁桃體在軟腭上的臨近連接部分?，F(xiàn)在，扁桃體已經(jīng)切除并可拿掉。

（9）將扁桃體放置在收集容器中。

（10）在包裝運送前擦掉容器表面的污染（血液、排泄物等）。

3.提交至實驗室的組織樣本（包括血清）的正確標簽貼法。動物健康官員收集的樣本貼的標簽應(yīng)與CSF等其他疾病計劃保持一致。所有樣本必須有NVSL提供的獨特條形碼。

◎圖3

使用防污/防水筆和條形碼標記每個管子或樣本收集容器。每個標簽上的內(nèi)容包括：樣本號；管子或容器內(nèi)的樣本類型（組織類型，即扁桃體、肺、肝等）；條形碼識別標簽。

條形碼印制為4個獨立標簽一組。各個樣本的條形碼互不相同，即便是從同一動物收集的多個樣本。

應(yīng)按照以下方法使用條形碼：每個樣本管上粘貼一個標簽—確保在管子上縱向粘貼條形碼；提交表單上粘貼一張標簽；應(yīng)銷毀未使用的標簽。此前使用過的條形碼的重復(fù)使用將“混淆”實驗室內(nèi)的自動樣本處理程序。所有血清樣本必須有獨立的條形碼（圖3）：將樣本放置在冷卻器中或冰袋上。不得冷凍樣本；適當(dāng)處理組織和畜體；將組織/血清送至合適的NAHLN實驗室 。