馬 燕，葉子瑜，梁艷芳，王 斌，陳莎莎， 顏慧敏，林碧華，周克元，梁 統(tǒng)，曾今誠(chéng)△

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)/廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué)/東莞市醫(yī)學(xué)活性分子開(kāi)發(fā)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；3.廣東省東莞市第五人民醫(yī)院病理科 523900)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)。雖然早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)治療可使很多患者得到根治，但25%的病例在初診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且約50%的患者最終發(fā)展成為不能切除的轉(zhuǎn)移病例[1]。對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者，化療是其主要的治療手段。然而，化療后中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間(TTP)仍舊很短(6～8個(gè)月)，提示結(jié)腸癌存在著內(nèi)在耐藥性或獲得性耐藥[2]。結(jié)腸癌耐藥是影響化療效果和患者預(yù)后的重要原因之一，因此，研究結(jié)腸癌耐藥的發(fā)生及其機(jī)制是化療增敏或逆轉(zhuǎn)耐藥的基礎(chǔ)。白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種多細(xì)胞來(lái)源并具有復(fù)雜生物學(xué)功能的單鏈糖蛋白細(xì)胞因子，相對(duì)分子質(zhì)量為26×103[3]。IL-6可參與炎癥反應(yīng)和急性時(shí)相反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)造血，并在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[4]。IL-6 及其受體的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，包括乳腺癌[5]、膀胱癌[6]、頭頸癌[7]、肝癌[8]等。有研究報(bào)道，IL-6與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，血漿高水平的IL-6往往提示預(yù)后不良[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可能介導(dǎo)了乳腺癌的順鉑(CDDP)耐藥[5]，靶向調(diào)節(jié)IL-6極有可能成為逆轉(zhuǎn)某些腫瘤耐藥的新靶點(diǎn)。目前，有關(guān)IL-6介導(dǎo)結(jié)腸癌耐藥的機(jī)制研究報(bào)道不多。本研究采用短回文重復(fù)序列/核酸內(nèi)切酶9(CRISPR/Cas9)技術(shù)構(gòu)建IL-6基因敲除的結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞系并評(píng)價(jià)其生物學(xué)活性及探討其對(duì)化療藥物CDDP的敏感性，為IL-6介導(dǎo)的結(jié)腸癌化療耐藥機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒與細(xì)胞株 phU6-sgRNA骨架質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，E.coli DH5ɑ感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技有限公司，SW1116細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑 Oligo引物購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；Prestained Protein Ladder、限制性內(nèi)切酶BsaBⅠ購(gòu)自Thermo公司；jetPRIME?試劑購(gòu)自Polyolus公司；T4 DNA Ligase購(gòu)自Fermentas公司；Trytone、Yeast Extract和Agar Powder購(gòu)自O(shè)XOID公司；2×Taq Plus Master Mix購(gòu)自Vazyme公司；Agarose購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；碘化丙啶(PI)、BCA蛋白定量試劑盒和CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；APC Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒(APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI)購(gòu)自BioLegend公司；IL-6、Cyclin E、Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3和GAPDH抗體購(gòu)自CST公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 利用CRISPR網(wǎng)絡(luò)工具(http://crispr.mit.edu)在人IL-6基因的合適位點(diǎn)選擇sgRNA的靶向序列，設(shè)計(jì)3個(gè)不同的sgRNA，即IL-6 sgRNA1-3。寡核苷酸序列如下，sgRNA1上游引物：5′-ACC GCA CTA CTC TCA AAT CTG TTC-3′，下游引物：5′-AAA CGA ACA GAT TTG AGA GTA GTG-3′；sgRNA2上游引物：5′-ACC GTT TGT CAA TTC GTT CTG AAG-3′，下游引物：5′-AAA CCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA-3′，sgRNA3上游引物：5′-ACC GGA ACA GAT TTG AGA GTA GTG-3′，下游引物：5′-AAA CCA CTA CTC TCA AAT CTG TTC-3′。在每條sgRNA序列正義鏈的5′端添加ACCG，反義鏈的5′端添加AAAC，與經(jīng)Bsa Ⅰ酶切后的phU6-sgRNA backbone表達(dá)質(zhì)粒載體形成的黏性末端互補(bǔ)，構(gòu)建Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將SW1116細(xì)胞接種至6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，使用轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME?進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(質(zhì)粒終濃度為1 μg/mL)，以等量空白載體為陰性對(duì)照。

1.2.3基因組DNA提取 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用細(xì)胞基因組提取試劑盒對(duì)各組SW1116細(xì)胞按照說(shuō)明書操作步驟提取細(xì)胞基因組。

1.2.4錯(cuò)配酶法(Surveyor)篩選高活性sgRNA 使用QI Aquick PCR purification Kit試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，將回收的產(chǎn)物稀釋至20 mg/L，按照Surveyor分析試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行檢測(cè)，2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.5IL-6基因敲除SW1116細(xì)胞株篩選 為了進(jìn)一步獲得穩(wěn)定敲除IL-6的SW1116細(xì)胞株，將Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞株48 h后，采用有限稀釋法將細(xì)胞接種至96孔板(保證單細(xì)胞接種)。待細(xì)胞擴(kuò)增至6孔板時(shí)，取部分細(xì)胞進(jìn)行傳代及保種，剩余細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測(cè)IL-6表達(dá)。

1.2.6Western blot法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá) RIPA裂解液和1%的蛋白酶抑制劑混合液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質(zhì)上樣質(zhì)量為50 μg，電泳完成后，依次進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)膜、50 g/L牛奶封閉、洗膜(1×TBST,5 min,3次)、孵育一抗(4 ℃過(guò)夜)、洗膜、孵育二抗(室溫1 h)、洗膜(1×TBST,5 min,3次)，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)印記條帶。

1.2.7CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 消化處理對(duì)數(shù)期SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細(xì)胞，約3 000個(gè)/孔接種至96孔板，分別于24、48、72 h更換新鮮培養(yǎng)基，吸取10 μL CCK-8溶液于待測(cè)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)為450 nm，檢測(cè)各孔光密度值(OD450)。

1.2.8PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期 培養(yǎng)SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細(xì)胞48 h，胰酶消化后離心，PBS清洗2次，1 mL 4 ℃ 75%乙醇重懸，固定12 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，200 μL PBS 重懸細(xì)胞，加入150 μL Rnase，37 ℃孵育40 min后加入200 μL PI溶液，4 ℃孵育2 h，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.9APC Annexin V-PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細(xì)胞48 h，胰酶消化細(xì)胞后離心，PBS清洗2次，加入195 μL Binding buffer重懸細(xì)胞。加入5 μL APC Annexin V混勻，再加入10 μL PI溶液，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.10藥物敏感性試驗(yàn) 消化處理對(duì)數(shù)期SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細(xì)胞，將1×104個(gè)/孔細(xì)胞接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，加入終濃度為5 mmol/mL的CDDP，置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 h更換新鮮培養(yǎng)基，吸取10 μL CCK-8溶液于待測(cè)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，檢測(cè)各孔OD450。

2 結(jié) 果

2.1IL-6基因敲除SW1116細(xì)胞株的建立與鑒定 根據(jù)IL-6基因序列，合成3個(gè)sgRNA寡核苷酸序列(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3)，將合成的序列分別與Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP質(zhì)粒(圖1A)進(jìn)行重組，分別得到Lenti-Cas9- IL-6-sgRNA-1-EGFP質(zhì)粒、Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-2-EGFP質(zhì)粒和Lenti-Cas9- IL-6-sgRNA-3-EGFP質(zhì)粒。采用QI Aquick PCR purification Kit試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，將回收產(chǎn)物通過(guò)T7E1酶切后2 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示針對(duì)IL-6-sgRNA-1有較好的打靶效率(圖1B)。采用有限稀釋法將Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞經(jīng)過(guò)克隆化培養(yǎng)，篩選得到4株單克隆細(xì)胞株，分別命名C1、C2、C3、C4，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)單克隆細(xì)胞IL-6表達(dá)量(圖1C)，結(jié)果顯示與對(duì)照組(NC)相比，C2～4細(xì)胞株表達(dá)少量IL-6，命名為IL-6-/+SW1116細(xì)胞株，C1細(xì)胞株完全不表達(dá)IL-6，將其命名為IL-6-/-SW1116細(xì)胞株。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(NC)相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP質(zhì)粒的SW1116細(xì)胞多表達(dá)綠色熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞株成功(圖1D)。

A：質(zhì)粒Leti-Cas9-IL-6-sgRNA-EGFP結(jié)構(gòu)示意圖;B：Surveyor法檢測(cè)sgRNA活性；C：Western blot檢測(cè)IL-6表達(dá)；D：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞(熒光下視野,×10)

2.2IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細(xì)胞增殖、周期和凋亡檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組SW1116細(xì)胞比較，IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細(xì)胞增殖無(wú)明顯差別(圖2A)；鏡下觀察三種細(xì)胞狀態(tài)基本一致，生長(zhǎng)良好(圖2B)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，SW1116細(xì)胞、IL-6-/-SW1116和IL-6-/+SW1116細(xì)胞各期(G1、S、G2期)細(xì)胞數(shù)量均無(wú)明顯差異(圖2C)；細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示IL-6基因敲除后，SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細(xì)胞的凋亡率均無(wú)明顯差異(圖2D)。Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞周期蛋白質(zhì)Cyclin E在SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116三種細(xì)胞中的表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)Cyclin E表達(dá)及定量分析

A：顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)(×200)；B：FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡；C：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；D：Western blot檢測(cè)Bax及Bcl-2等表達(dá);E：Bax及Bcl-2等表達(dá)定量分析；a:P<0.05，b：P<0.01，與SW1116比較；c：P<0.01,與IL-6-/- SW1116比較

2.3CDDP干預(yù)對(duì)IL-6-/-SW1116細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)Bax等表達(dá)的影響 與SW1116細(xì)胞相比，終濃度為5 mmol/mL CDDP 作用IL-6-/+SW1116和 IL-6-/-SW1116細(xì)胞72 h后，IL-6-/-SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯變差(圖4A)，細(xì)胞凋亡率增加(圖4B)，細(xì)胞增殖受到明顯抑制(圖4C)。Western blot結(jié)果顯示IL-6-/-SW1116細(xì)胞胞內(nèi)Bax表達(dá)顯著增高，Bcl-2、p-STAT3和STAT3表達(dá)顯著降低，見(jiàn)圖4D、E。

3 討 論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是新近發(fā)展起來(lái)的、廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和植物中的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，具有精確的靶向功能。本研究采用Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP骨架質(zhì)粒構(gòu)建得到Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-1-EGFP、Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-2-EGFP和Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-3-EGFP重組質(zhì)粒，并通過(guò)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞，經(jīng)篩選鑒定得到一株IL-6基因全敲除和IL-6基因部分敲除的結(jié)腸癌細(xì)胞系：IL-6-/+SW1116和IL-6-/-SW1116細(xì)胞。該兩種細(xì)胞除IL-6表達(dá)受到影響外，其細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期變化均于野生型SW1116無(wú)明顯差異(P>0.05)，提示IL-6基因敲除可能并不影響結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。值得注意的是，當(dāng)采用終濃度為5 mmol/mL CDDP分別干預(yù)野生型SW1116、IL-6-/+SW1116和IL-6-/-SW1116細(xì)胞72 h后，IL-6-/-SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯變差，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，提示IL-6-/-SW1116細(xì)胞對(duì)CDDP敏感性增加。Western blot檢測(cè)顯示CDDP干預(yù)后，IL-6-/-SW1116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減低。

IL-6是一種多功能、多效性細(xì)胞因子，主要由位于腫瘤微環(huán)境內(nèi)的多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞本身[10-11]。IL-6/JAK/STAT3途徑在多種實(shí)體腫瘤(如乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和頭頸癌等)中過(guò)度活化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)[7-10]。在腫瘤微環(huán)境中，IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移，且強(qiáng)烈抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[12]。IL-6直接作用于腫瘤細(xì)胞以誘導(dǎo)STAT3靶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖相關(guān)蛋白質(zhì)(如Cyclin D1，Cyclin E)、血管生成因子(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(如基質(zhì)金屬蛋白酶)和免疫抑制因子(如IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)表達(dá)[12-14]。STAT3也可促進(jìn)IL-6基因表達(dá)，從而形成自分泌反饋環(huán)[14]。STAT3還促進(jìn)對(duì)常規(guī)化療和放療及靶向治療(如西妥昔單抗)的耐藥性[15]。有研究顯示通過(guò)正反饋回路激活STAT3可能是藥物處理的癌細(xì)胞耐藥的主要機(jī)制，結(jié)果顯示外周血高水平IL-6與結(jié)腸癌患者腫瘤大小、分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)[14,16]。作者所在課題組亦發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織高表達(dá)IL-6，且與腫瘤大小、分化程度、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等密切相關(guān)(結(jié)果待報(bào)道)。

為了進(jìn)一步探討腫瘤源性IL-6在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展及耐藥中的作用，本研究建立了穩(wěn)定的IL-6基因敲除結(jié)腸癌細(xì)胞系，結(jié)果顯示IL-6基因敲除結(jié)腸癌細(xì)胞系對(duì)化療藥物CPPD敏感性增加，且該過(guò)程可能與STAT3信號(hào)通路受到抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了對(duì)CDDP敏感，且細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、周期穩(wěn)定的IL-6基因敲除結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞系，可為深入探索IL-6介導(dǎo)的結(jié)腸癌化療耐藥機(jī)制提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。