周程繼，王 攀△，喻 晶，魏壽江，王崇樹

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，四川南充 637000；2.醫(yī)學(xué)影像四川省重點實驗室，四川南充 637000)

大腸癌是世界上最常見的惡性消化道腫瘤之一，是導(dǎo)致癌癥患者死亡的第四大原因，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[1-2]。已有研究表明，腫瘤缺氧微環(huán)境可促進腫瘤的進展及轉(zhuǎn)移。而目前對于缺氧-復(fù)氧(H-R)腫瘤微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞由于不規(guī)則的微血管網(wǎng)和血流模式，腫瘤細胞亦處于H-R腫瘤微環(huán)境中[3-4]。作者旨在探討H-R條件下能否促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)細胞培養(yǎng)和細胞株：人結(jié)腸癌LOVO株由陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院普外科實驗室凍存保留，復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)主要試劑和抗體：二亞苯基碘鎓(DPI)為美國Sigma公司產(chǎn)品，一抗鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體和鼠抗人MMP-9單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Western及IP細胞裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒及預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，Transwell小室為美國Corning 公司產(chǎn)品，BD Matrigel為美國BD-Bio公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1H-R養(yǎng)條件的建立 常氧培養(yǎng)組(N組)：細胞培養(yǎng)在95%空氣、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h作為對照。H-R培養(yǎng)條件參照文獻[5]進行：LOVO細胞在37 ℃，5%CO2和95%N2的混合氣體的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；再將細胞放入95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)20 h，即完成H-R培養(yǎng)(H-R組)。

1.2.2活性氧(ROS)的檢測 LOVO細胞胰酶消化后，均勻接種培養(yǎng)于96孔板(25×103細胞/孔)，每組設(shè)3個重復(fù)孔。細胞H-R前分別給予嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑DPI 15 μmol/L(H-R+DPI組)和抗氧化劑NAC 30 mmol/L(H-R+NAC組)預(yù)處理1 h。ROS的檢測采用熒光探針二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCF-DA)：H-R培養(yǎng)后用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基稀釋DCF-DA至終濃度10 μmol/L，與細胞37 ℃共同孵育20 min后，用無FBS的DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞3次，自動熒光酶標儀(激發(fā)波長488 nm；發(fā)射波長525 nm)檢測細胞內(nèi)ROS水平。所有測量均在37 ℃進行。

1.2.3傷口愈合實驗 LOVO細胞6孔板內(nèi)培養(yǎng)至80%～90%近單層融合狀態(tài)，用滅菌的200 μL槍頭分別作3條劃痕(間距約1 cm)，懸浮細胞用PBS洗凈。H-R組傷口愈合實驗：DPI 15 μmol/L、NAC 30 mmol/L分別預(yù)處理細胞1 h，再行H-R培養(yǎng)。N組作對照。劃痕處分別在0、24 h拍照，IamgeProPlus軟件計算劃痕愈合面積。

1.2.4細胞侵襲實驗 Boyden小室(每組3小室)檢測細胞侵襲數(shù)目：冷的過濾蒸餾水稀釋基質(zhì)膠后，均勻加入到8 μm孔徑小室上室。對數(shù)期生長的LOVO細胞胰酶消化后計數(shù)，無血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)密度至3×105個/mL，取300 μL細胞懸液加入Boyden小室上部。下室用10% FBS作為趨化物。各實驗組細胞分別給予DPI 15 μmol/L和NAC 30 mmol/L預(yù)處理1 h，H-R培養(yǎng)后多聚甲醛固定侵襲細胞30 min后，結(jié)晶紫染色。N組常規(guī)進行。光學(xué)顯微鏡下(×400)隨機選擇3個區(qū)域細胞計數(shù)，取平均值，并計算相對于N組的百分比(%)。

1.2.5Western blot分析 用EP管收集細胞懸液后，13 000 r/min離心20 s棄上清液，加入600 μL蛋白裂解液冰上裂解30 min，2 500 r/min離心5 min，上清液移入新的EP管中，BCA法測定蛋白濃度，40 μg總蛋白于10%SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含3%BSA封閉液室溫下?lián)u動封閉1 h，4 ℃適當稀釋濃度的一抗MMP-2，MMP-9及GAPDH 孵育過夜，目的蛋白分子量大小采用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準判斷，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影免疫反應(yīng)帶進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1各組LOVO細胞ROS水平比較 相對于N組(99.90±9.79)%，H-R組細胞內(nèi)ROS水平[(270.51±20.32)%]明顯升高(P<0.01)；H-R+DPI、H-R+NAC組細胞內(nèi)ROS水平分別為(67.17±7.46)%、(56.53±3.78)%，與H-R組比較均明顯降低(P<0.05)。

2.2各組細胞劃痕愈合面積比較 N組、H-R組細胞劃痕愈合面積分別為(68.73±2.56)%、(83.30±2.67)%，H-R組LOVO細胞的遷移能力明顯強于N組(P<0.05)；H-R+DPI、H-R+NAC組細胞劃痕愈合面積分別為(47.37±4.13)%、(30.91±1.15)%，與H-R組比較均明顯降低(P<0.05)，見圖1。

2.3各組細胞體外相對細胞侵襲數(shù)比較 相對于N組(99.67±4.04)%，H-R組細胞侵襲能力[(168.33±8.08)%]明顯增強(P<0.05);H-R+DPI、H-R+NAC組相對細胞侵襲數(shù)分別為(48.12±2.65)%、(37.33±4.16)%，與H-R組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.4各組LOVO細胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較 與N組比較，H-R組LOVO細胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與H-R組比較，H-R+DPI、H-R+NAC組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖3。

A:N組；B：H-R組；C：H-R+DPI組；D：H-R+NAC組

A:N組；B：H-R組；C：H-R+DPI組；D：H-R+NAC組

a：P<0.05，與N組比較；b：P<0.05，與H-R組比較

3 討 論

有研究表明，局部缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的一種重要的共同特征，腫瘤細胞暴露于缺氧條件下的可導(dǎo)致腫瘤惡性表型的轉(zhuǎn)化，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[6]。LEE等[7]研究發(fā)現(xiàn)，實體腫瘤微血管網(wǎng)和血流模式與正常組織間存在較大的差異，這導(dǎo)致腫瘤細胞亦處于H-R的微環(huán)境中。

在生理情況下，正常細胞在H-R的微環(huán)境中可產(chǎn)生大量的ROS,但產(chǎn)生的ROS可不斷被機體的抗氧化系統(tǒng)清除，不致對機體產(chǎn)生嚴重的組織損傷，從而維持體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，其依賴于細胞穩(wěn)定的氧化還原系統(tǒng)[8]。但腫瘤細胞由于氧化還原系統(tǒng)的缺陷，對ROS的清除能力明顯降低，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS的持續(xù)升高[9]。而ROS可作為第二信使參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過程[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H-R條件下LOVO細胞中的ROS水平明顯升高(P<0.05)，在H-R的條件下給予LOVO細胞DPI或NAC處理后ROS的產(chǎn)生明顯減少(P<0.05)。以上研究表明，結(jié)腸癌細胞在H-R微環(huán)境中ROS的表達明顯增高，本課題前期研究也得出了類似的結(jié)論[5]。同時還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中，必須進行細胞形態(tài)和體積的變化，以使其通過狹窄外間隙而發(fā)生轉(zhuǎn)移[11]。ROS的上調(diào)可能導(dǎo)致細胞形態(tài)的改變和增強細胞的運動能力[12]。此外，ROS所介導(dǎo)的信號通路，如ROS/ERK信號通路在腫瘤細胞遷移中起著重要作用[13]。因此，本課題通過劃痕實驗研究H-R條件下抑制ROS的產(chǎn)生對結(jié)腸癌細胞遷移的影響。傷口愈合和侵襲實驗進一步觀察結(jié)果顯示，H-R處理后結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能明顯增強，但是這種作用可被DPI或NAC消除，與H-R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明結(jié)腸癌細胞在H-R微環(huán)境中可促進腫瘤的遷移能力，這種促進作用可能是通過提高細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而實現(xiàn)。

MMPs幾乎能降解細胞外基質(zhì)(ECM)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，在癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，從而在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，被認為是該過程中主要的蛋白水解酶[14]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的非常重要的兩個成員，二者是導(dǎo)致大腸癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要因素[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在H-R條件下LOVO細胞MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯上調(diào)，結(jié)腸癌細胞的侵襲能力明顯增強，從而表明MMP-2和MMP-9蛋白可能參與了結(jié)腸癌細胞在H-R微環(huán)境中的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，采用ROS的抑制劑DPI和NAC分別處理H-R組細胞后，結(jié)腸癌LOVO細胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。因此，本研究認為，MMP-2和MMP-9可作為ROS的下游信號分子參與結(jié)腸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程，可通過抑制ROS的產(chǎn)生來阻止結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，H-R腫瘤微環(huán)境在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，其作用可能是通過提高細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而實現(xiàn)，ROS/MMPs信號通路在H-R微環(huán)境中可能對結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的促進作用，而其深入的機制還有待進一步的研究。