田懷香，何玉潔，周興鑫，鄭小平，何亞斌，于海燕，陳 臣,*

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海必諾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200436）

乳及乳制品因其高營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn)在世界范圍內(nèi)的發(fā)展速度有目共睹，是當(dāng)今最具發(fā)展?jié)摿颓熬暗氖称分?。作為乳及乳制品的源頭，生鮮乳的安全保障是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，生鮮乳中獸藥殘留問題備受關(guān)注[1]。針對(duì)獸藥殘留，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告[2]中作出了明確的限量要求，實(shí)際檢測(cè)中需要嚴(yán)格遵守。但違規(guī)使用獸藥的情況仍然非常嚴(yán)重[3]。

常用的獸藥殘留檢測(cè)方法包括電泳法[4]、氣相色譜法[5-6]、液相色譜法[7-8]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-14]等。氣相色譜法檢測(cè)涉及衍生操作，適用性窄；液相色譜法分離效率較低，專屬性不強(qiáng)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法作為使用廣泛的獸藥殘留檢測(cè)方法，雖然靈敏度高，在定性定量方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)[15-17]；但是在大通量篩查時(shí)，其檢測(cè)獸藥化合物的數(shù)量有限，通常為幾十種[18-19]。

高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem time-of-flight mass spectrometry，HPLC-TOF-MS/MS）法相比低分辨率的液相色譜-質(zhì)譜而言，縮短分析時(shí)間的同時(shí)，還大大提高了分析的化合物數(shù)目[20-21]。一次進(jìn)樣分析中，TOF可進(jìn)行一次快速全掃描，獲得所有母離子信息；此外，結(jié)合信息相關(guān)分析模式（information dependent acquisition，IDA），對(duì)達(dá)到一定強(qiáng)度的子離子進(jìn)行二級(jí)碎片的確證，使定性更加精確。Martin等[22]利用HPLC/Q-TOF-MS方法對(duì)廢水和河水中阿托伐他汀、氟伐他汀等6 種抑制素的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，并分析對(duì)比3 種提取方法的儀器方法檢出限，分別為固相萃?。?.04～11.2 ng/L）、分散液液萃?。?.10～17.0 ng/L）、攪拌棒吸附萃取（0.52～2.00 ng/L），具有較高的靈敏度，Gu Junfei等[23]用此法結(jié)合固相萃取分析檢測(cè)了老鼠血清中4 種馬兜鈴酸，在日內(nèi)和日間出峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～1.5%，具有較好的穩(wěn)定性。Song Haojing等[24]用HPLC/Q-TOF-MS/MS第一次檢測(cè)巖白菜素在老鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，檢測(cè)樣主要為老鼠肉、膽汁、尿液和糞便，檢測(cè)結(jié)果通過總離子色譜圖和二級(jí)離子質(zhì)譜碎片圖光譜信息為目標(biāo)物及代謝碎片化合物進(jìn)行定性分析等。

鑒于國(guó)內(nèi)對(duì)于高通量獸藥篩查的研究較少，本研究主要利用HPLC-TOF-MS/MS方法對(duì)生鮮乳中可能存在殘留風(fēng)險(xiǎn)的獸藥化合物進(jìn)行篩查。這些獸藥涵蓋了β-內(nèi)酰胺類、β-興奮劑、阿維菌素類、苯并咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、非甾體類消炎藥、磺胺類、抗球蟲劑、喹諾酮類、類固醇類、林可酰胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、糖皮質(zhì)類、硝基咪唑類、鎮(zhèn)靜劑和其他共17 類獸藥化合物，為實(shí)際生鮮乳中獸藥殘留的篩查提供了一個(gè)簡(jiǎn)單且快速的檢測(cè)方法，大大提高了篩查效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用生鮮乳均來自上海各牧場(chǎng)，其中經(jīng)檢測(cè)不含目標(biāo)待測(cè)化合物的生鮮乳即為空白樣品。

β-內(nèi)酰胺類、β-興奮劑、阿維菌素類、苯并咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、非甾體類消炎藥、磺胺類、抗球蟲劑、喹諾酮類、類固醇類、林可酰胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、糖皮質(zhì)類、硝基咪唑類、鎮(zhèn)靜劑和其他共17 類獸藥化合物，共174 種獸藥化合物標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma Aldrich公司。所有標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇或水配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃儲(chǔ)存。中間液用甲醇配制，質(zhì)量濃度為10 μg/mL，于-20 ℃儲(chǔ)存；臨用時(shí)，配制成質(zhì)量濃度為200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20 ℃儲(chǔ)存。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷（均為色譜純）美國(guó)Thermo公司；甲酸、氯化鈉、無水硫酸鈉（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600 MS儀（配有電噴霧離子源） 美國(guó)AB SCIEX公司；ACQUITY HPLC儀、Oasis PriME萃取柱（60 mg/3 mL） 美國(guó)Waters公司；Cleanert PEP-Plus（60 mg/3 mL）萃取柱 美國(guó)Agela公司；SORVALL ST 16R離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)IKA公司；氮?dú)鉂饪s儀 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Milli-Q超純水制造儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

精確稱取生鮮乳樣2 g于50 mL離心管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液500 μL，振蕩，靜置10 min。加入1 g氯化鈉和1 g無水硫酸鈉，振蕩。加入10 mL的乙腈，渦旋振蕩處理5 min，于10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一50 mL離心管中。再加入10 mL的乙腈溶液重新提取一次，同樣條件離心后上清液合并。再加入10 mL乙酸乙酯提取一次，同樣離心條件離心后合并上清液，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，1 mL甲醇復(fù)溶。于-20 ℃冷凍2 h以上，于10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

既往研究表明Ki67表達(dá)率以及人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)與nSLN轉(zhuǎn)移與否無相關(guān)性[11]。Ki67表達(dá)率≤30%時(shí)，nSLN轉(zhuǎn)移率為45%(14/31)；而Ki67表達(dá)率>30%時(shí)，nSLN轉(zhuǎn)移率為42%(14/33)。單因素分析結(jié)果顯示，組間差異P值=0.825，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HER-2為陽性時(shí)，nSLN轉(zhuǎn)移率為50%(8/16)；而HER-2結(jié)果為陰性時(shí)，nSLN轉(zhuǎn)移率為42%(20/48)。單因素分析結(jié)果顯示，組間差異P值=0.561，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液和甲醇；流速：350 μL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；線性梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3 MS條件

離子源：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；掃描模式：正離子掃描（ESI+）；檢測(cè)方式：全離子掃描；掃描范圍m/z 100～1 000；電噴霧電壓：5 500 V；霧化氣流量和輔助氣流量均為55 L/h；氣簾氣流速35 L/h；離子源溫度600 ℃。去簇電壓80 V；碰撞能量10 V；離子累積加速時(shí)間0.25 s。

在上述MS條件下，增加信息相關(guān)掃描，監(jiān)測(cè)響應(yīng)值超過1 000的化合物，得到其子離子信息，掃描范圍m/z 50～1 000，去簇電壓60 V；碰撞能量（35±15）V；擴(kuò)展碰撞能量15 V；離子累積加速時(shí)間0.1 s。

一級(jí)全掃描獲得的高精度相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)用于篩選及定性分析，IDA全掃描獲得的二級(jí)碎片離子信息用于加強(qiáng)定性確證。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用儀器Peak View軟件對(duì)篩查譜圖進(jìn)行定性分析，Multi Quant軟件對(duì)方法驗(yàn)證中回收率等指標(biāo)進(jìn)行分析處理；采用Excel軟件分析精密度；采用Origin 9軟件對(duì)圖像進(jìn)行調(diào)整處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)篩查譜庫的建立結(jié)果

用200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立174 種目標(biāo)獸藥化合物的篩查譜庫，相比于國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的獸藥殘留檢測(cè)報(bào)道[25-27]，種類、數(shù)量大大增加。其總離子流色譜圖不能清晰地反應(yīng)各化合物的具體信息，圖1為苯并咪唑類物質(zhì)的提取離子色譜圖和二級(jí)碎片譜庫比對(duì)圖，174 種目標(biāo)獸藥化合物的質(zhì)譜相關(guān)信息和保留時(shí)間見表2。

圖1 9 種苯并咪唑的選擇離子色譜圖和二級(jí)離子色譜圖信息Fig. 1 Extracted ion chromatograms and secondary ion chromatogram information of nine benzimidazoles

2.2 凈化方法的優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)比較過柱凈化和冷凍凈化對(duì)于目標(biāo)分析獸藥化合物的回收情況。所選用凈化小柱為Oasis PRiME柱和Cleanert PEP-Plus柱。過柱凈化步驟：3 mL甲醇、3 mL水預(yù)洗，1 mL甲醇定容液過柱，開始接收洗脫液，5 mL甲醇洗脫，合并洗脫液，氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇復(fù)溶；冷凍凈化操作為-20 ℃冷凍2 h以上，10 000 r/min離心5 min；過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)。最終結(jié)果以Peak View軟件結(jié)合本實(shí)驗(yàn)所建立數(shù)據(jù)庫所篩查出的獸藥化合物個(gè)數(shù)確定凈化方法的優(yōu)劣，結(jié)果見圖2。

表2 174 種獸藥化合物綜合信息Table 2 Figures of merit of the method for 174 veterinary drug residues

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

圖2 凈化處理方式對(duì)篩查結(jié)果的影響Fig. 2 Effect of different purification methods on the number of veterinary drugs screened

由圖2可知，過柱凈化后所篩查出的目標(biāo)獸藥化合物數(shù)目遠(yuǎn)低于冷凍凈化后所篩查出的目標(biāo)獸藥化合物數(shù)目；此外，過柱凈化[25,28-29]比冷凍凈化耗時(shí)長(zhǎng)，不利于后續(xù)大批量樣品數(shù)據(jù)的采集；故選用冷凍凈化作為本實(shí)驗(yàn)的除脂除雜技術(shù)。

2.3 提取試劑的優(yōu)選結(jié)果

使用乙腈（或甲酸-乙腈）與乙酸乙酯按照1.3.1節(jié)步驟對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行提取，分別使用兩種凈化方法（采用2.2節(jié)中優(yōu)選的凈化柱）凈化后，供HPLC-TOF-MS/MS分析檢測(cè)。通過對(duì)比總離子流色譜圖中各化合物數(shù)量、以及可獲得較好回收率（70%～130%）的目標(biāo)分析化合物數(shù)量結(jié)果，結(jié)合Peak View軟件篩查出的目標(biāo)化合物數(shù)量結(jié)果，最終選出較優(yōu)提取試劑，結(jié)果見圖3。

圖3 提取處理方式對(duì)篩查結(jié)果的影響Fig. 3 Effect of different extraction methods on the number of veterinary drugs screened

由圖3可知，無論是過柱凈化還是冷凍凈化，甲酸的加入沒有明顯提高對(duì)于目標(biāo)化合物的提取，反而略有降低。未提取出的化合物主要是螺旋霉素、吉他霉素、氯霉素、金霉素和四環(huán)素等極不穩(wěn)定的獸藥。故最終選擇純乙腈與乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.4 儀器條件的選擇結(jié)果

2.4.1 液相色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，用200 ng/mL質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液選擇優(yōu)化了3 種常用化合物分離色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH HILIC柱（BEH柱，2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；ACQUITY UPLC?CSHTMC18柱（CSH柱，2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Poroshell 120 EC-C18柱（P120柱，3.0 mm×150 mm，2.7 μm）。結(jié)果顯示，從目標(biāo)化合物峰的分離度看，CSH柱的效果優(yōu)于BEH柱和P120柱，但是由于CSH柱和BEH柱中大部分出峰時(shí)間比較靠前，受溶劑影響比較大；而P120柱中目標(biāo)化合物的出峰位置相對(duì)偏中，受溶劑影響相對(duì)較小，同時(shí)也方便后續(xù)液相洗脫程序的優(yōu)化；此外，相對(duì)CSH柱和BEH柱，P120柱中色譜的整體響應(yīng)強(qiáng)度更高，有利于充分的對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。故色譜柱最終選擇為Poroshell 120 EC-C18柱。

2.4.2 流動(dòng)相的選擇

在前人總結(jié)的基礎(chǔ)上，多種獸藥篩查所用流動(dòng)相主要是甲醇或乙腈與水。分別對(duì)甲醇和乙腈按照上述洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種有機(jī)溶劑的使用對(duì)多種獸藥目標(biāo)化合物的分離影響不顯著，最后選擇甲醇和水作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。此外，經(jīng)參考文獻(xiàn)[30]，發(fā)現(xiàn)甲酸的加入對(duì)于正離子掃描模式的峰形、峰的分離度，尤其是峰的響應(yīng)強(qiáng)度有顯著地改善，本實(shí)驗(yàn)也對(duì)其效果進(jìn)行驗(yàn)證，見圖4。

由圖4可明顯發(fā)現(xiàn)，加入0.1%的甲酸對(duì)于部分化合物的響應(yīng)強(qiáng)度的確具有明顯的提高，故本實(shí)驗(yàn)最終選擇的流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液和甲醇。

2.5 生鮮乳中獸藥殘留篩查方法的驗(yàn)證結(jié)果

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限

準(zhǔn)確吸取上述200 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0、125、250、500、750、1 000 μL于15 mL玻璃試管中，50 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL空白生鮮乳基質(zhì)提取液復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Multi Quant軟件分析，以質(zhì)量濃度x作為橫坐標(biāo)，峰面積y作為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得線性方程。結(jié)果表明，絕大部分化合物在0～200 ng/mL范圍內(nèi)，各化合物面積與質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系，其中，R2大于0.990 0的高達(dá)114 種。線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表2。

取空白生鮮乳樣品2 g，分別加入不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制成含目標(biāo)化合物1.0、5.0、10.0、20.0 ng/g的樣品，渦旋混勻，避光靜置30 min使其接觸充分，與樣品同法處理后進(jìn)樣測(cè)定信噪比。以RSN≥3時(shí)的濃度作為檢測(cè)限，檢測(cè)限在1～10 ng/g之間，符合檢測(cè)要求，其檢測(cè)限結(jié)果見表2。

2.5.2 回收率與精密度

稱取同一來源的空白生鮮乳樣品若干份，每份2 g，分別添加不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成10 ng/g和50 ng/g水平的質(zhì)控樣，按照樣品同法處理后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率與精密度。結(jié)果表明，在質(zhì)控水平，本方法對(duì)絕大多數(shù)目標(biāo)獸藥化合物加標(biāo)回收率較好：其中50 ng/g添加水平下，回收率在70%～130%之間的獸藥化合物高達(dá)99 種；重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%～9.65%，見表2。

2.6 實(shí)際樣品分析

本研究將建立好的HPLC-TOF-MS/MS方法用于實(shí)際生鮮乳中獸藥殘留分析，篩查來自上海不同牧場(chǎng)的50 個(gè)生鮮乳樣，共有13 個(gè)樣品獸藥檢出，涵蓋糖皮質(zhì)、磺胺、β-內(nèi)酰胺、β-興奮劑、類固醇類，結(jié)果見表3。

表3 實(shí)際生鮮乳獸藥殘留篩查結(jié)果Table 3 Screening results for veterinary drug residues in real milk samples

3 結(jié) 論

本研究利用乙腈和乙酸乙酯將目標(biāo)獸藥化合物從生鮮乳中提取出來，結(jié)合冷凍凈化技術(shù)除脂除雜；采用優(yōu)化的HPLC-TOF-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)分析，建立生鮮乳中17 大類，174 種獸藥的篩查方法，并將其應(yīng)用到實(shí)際生鮮乳樣品的獸藥殘留篩查。結(jié)果表明：方法簡(jiǎn)單快速，經(jīng)驗(yàn)證具有較高的精準(zhǔn)度和靈敏度，適用于復(fù)雜基質(zhì)生鮮乳中高通量獸藥化合物的篩查。