閆競(jìng)宇, 丁俊杰, 金高娃, 郭志謀, 梁鑫淼

中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023

糖是一類重要的生命活性物質(zhì)，它不僅是細(xì)胞能量代謝的源泉，還常作為信號(hào)分子參與細(xì)胞的各種活動(dòng)，例如分子識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫等過(guò)程。近年來(lái)，人體來(lái)源的低聚糖由于與人體健康息息相關(guān)而引起科研工作者的關(guān)注，從人體來(lái)源的龐大糖庫(kù)中尋找有益的寡糖已經(jīng)成為功能性寡糖研究的主要方向之一。在人源性寡糖中，來(lái)源于人乳中的低聚糖——人乳寡糖，由于其含量高、種類豐富并且與嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)而引起人們的重視。

人乳作為嬰兒出生時(shí)唯一的食物來(lái)源，一方面其幾乎含有嬰兒必須的所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及微量的礦物質(zhì)元素和維生素等，另一方面人乳對(duì)嬰兒完善免疫系統(tǒng)、生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有重要的作用，而這些功能的實(shí)現(xiàn)與人乳中的寡糖組分密切相關(guān)[1～3]。人乳寡糖是人乳區(qū)別于其他哺乳動(dòng)物乳汁的最主要成分，主要表現(xiàn)在：①人乳寡糖在乳汁中的含量是哺乳動(dòng)物中含量最高的。1 L人乳中約含有5～20 g人乳寡糖，尤其在初乳中含量更高，1 L初乳中人乳寡糖可以達(dá)到20～25 g。而其他哺乳動(dòng)物的乳汁相比較之下寡糖含量要低上百倍，例如在1 L牛奶中寡糖含量?jī)H為0.03～0.06 g，山羊奶中寡糖含量為0.25～0.30 g，綿羊奶中僅含有0.02～0.04 g[4]。②人乳寡糖結(jié)構(gòu)種類最多。豐富的種類也是人乳寡糖區(qū)別于其他哺乳類動(dòng)物乳汁的重要特征。據(jù)預(yù)測(cè)人乳寡糖的種類可達(dá)到數(shù)百種，2010年日本學(xué)者Kobata[5]綜述了近百種已發(fā)現(xiàn)的人乳寡糖結(jié)構(gòu)，而目前所報(bào)道的牛乳、羊乳中寡糖僅有數(shù)十種[6]。③人乳寡糖結(jié)構(gòu)組成同其他哺乳動(dòng)物也有較大差異。人乳寡糖結(jié)構(gòu)由5個(gè)基本糖單元組成，即葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、巖藻糖(Fuc)和唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸-Neu5Ac)。這些寡糖一般在還原末端有一個(gè)乳糖，在乳糖的非還原端被不同數(shù)量的Galβ1-3GlcNAc (TypeⅠ) 或Galβ1-4GlcNAc (TypeⅡ) 單元分別以β1-3或β1-6方式延長(zhǎng)成直鏈或支鏈寡糖結(jié)構(gòu)(圖1,彩圖見(jiàn)圖版一)。尤其值得注意的是人乳中所含有的唾液酸化寡糖組成是Neu5Ac，而其他哺乳動(dòng)物的乳汁中如牛奶、羊奶中含有人體外源性的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)，且人乳中巖藻糖化寡糖和唾液酸的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他哺乳類動(dòng)物。正是由于人乳寡糖的差異性存在，使人乳變得非?！疤貏e”，也使人乳成為嬰兒配方奶粉不能企及的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。

圖1 人乳寡糖結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic illustration of compositions and structures of HMOs.(彩圖見(jiàn)圖版一)

與牛乳和其他哺乳動(dòng)物的乳汁相比，人乳寡糖的高含量和結(jié)構(gòu)的多樣性賦予了其一些特殊的生物學(xué)功能[7～9]。其中，人乳寡糖最為人熟知的功能是作為益生元調(diào)節(jié)嬰兒腸道菌群。大多數(shù)的人乳寡糖不會(huì)被嬰兒消化道消化，幾乎全部以原型形式抵達(dá)小腸和結(jié)腸，在那里被某些益生菌如一些雙歧桿菌所利用，從而促進(jìn)這些益生菌的生長(zhǎng)，同時(shí)人乳寡糖被腸道菌群利用代謝后，產(chǎn)生短鏈的脂肪酸，可降低嬰兒腸道內(nèi)的pH，抑制了致病菌如梭狀芽胞桿菌、埃希氏大腸桿菌等的繁殖，進(jìn)而維持腸道的微生態(tài)平衡，保護(hù)嬰兒腸道健康。人乳寡糖另外一個(gè)重要的功能就是通過(guò)抗微生物黏附進(jìn)而改善機(jī)體的防御功能。病毒、細(xì)菌等病原體侵入人體時(shí)首先要和宿主結(jié)合，最常見(jiàn)的方式為黏附上皮細(xì)胞表面受體，這些與病原體結(jié)合的受體多為糖復(fù)合物例如糖蛋白或者糖脂上的糖鏈，而人乳寡糖中的糖與這些受體在結(jié)構(gòu)上非常相似，可以作為水溶性受體“引誘”病原體或致病菌與其結(jié)合從而被排出體外，實(shí)現(xiàn)了對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。例如含有1,2-巖藻糖的寡糖可以阻斷空腸彎曲桿菌的黏附，也能中和大腸桿菌產(chǎn)生的耐熱內(nèi)毒素，從而降低這些因素引發(fā)的嬰兒腹瀉。

隨著對(duì)人乳以及糖生物學(xué)研究的深入，人乳中糖類成分的功能逐漸被重視和發(fā)現(xiàn)，但想要進(jìn)一步揭示其生物學(xué)功能，首先需要對(duì)其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的解析。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外圍繞人乳寡糖分離分析的研究工作逐漸增加，本文從人乳寡糖前處理、分離分析和結(jié)構(gòu)表征三方面對(duì)當(dāng)前主要研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為人乳寡糖結(jié)構(gòu)與功能的深入研究工作提供參考。

1 人乳寡糖的預(yù)處理方法

人乳寡糖主要存在于乳清液中，通常的提取方法需要將母乳中的脂肪和蛋白質(zhì)進(jìn)行去除。脂肪的去除方法通常采用低溫離心的方式，蛋白質(zhì)主要采用有機(jī)溶劑沉淀，經(jīng)過(guò)上述兩步前處理過(guò)程后獲得的乳清液主要含有乳糖和寡糖成分。乳糖和寡糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)類似，含量是寡糖的5～20倍，是對(duì)寡糖分析干擾最大的成分，通常需要一定的前處理方法對(duì)高含量的乳糖進(jìn)行去除。

尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography, SEC)是分離人乳寡糖的傳統(tǒng)技術(shù)，其分離過(guò)程是根據(jù)被分析物的分子體積大小及形狀，按順序被洗脫出色譜柱而達(dá)到分離的目的。人乳寡糖在SEC上的洗脫順序依次為唾液酸化寡糖、聚合度從高到低的中性寡糖、乳糖。Asakuma等[10]采用Bio Gel P-2、DEAE Sephadex A-50和Bio Gel P-4依次對(duì)人乳寡糖樣品進(jìn)行純化和粗分離，最后得到中性寡糖組分，衍生化后繼續(xù)用反相色譜進(jìn)行定量分析的方法，對(duì)日本人群中不同哺乳期8種中性寡糖含量變化進(jìn)行了研究。由此可見(jiàn)使用 SEC 不僅可以去除乳糖，還可以實(shí)現(xiàn)寡糖的初步分離，在早期寡糖化合物純化方面得到了廣泛應(yīng)用，但由于其處理的通量比較低，不適用于高通量的樣品分析。

固相萃取(solid phase extraction, SPE)技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的樣品前處理技術(shù)之一，具有高通量、易自動(dòng)化、操作靈活等優(yōu)點(diǎn)，石墨化碳是寡糖類樣品預(yù)處理的常用固相萃取吸附材料。Lebrilla團(tuán)隊(duì)針對(duì)人乳寡糖設(shè)計(jì)了一個(gè)高通量SPE處理流程[11]，該流程同時(shí)實(shí)現(xiàn)了寡糖還原、脫鹽、脫乳糖以及分離中性糖和酸性糖等目標(biāo)，配合后面的納升-液相芯片質(zhì)譜分析(nano-LC chip)可以實(shí)現(xiàn)人乳寡糖的定性定量分析。近期本課題組發(fā)展了一種在線SPE親水色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法(圖2)，通過(guò)兩種帶有不同電荷的親水色譜柱對(duì)寡糖的選擇性差異，實(shí)現(xiàn)了人乳和其他哺乳動(dòng)物乳汁中唾液酸化寡糖的分離分析，結(jié)果顯示人乳同其他哺乳動(dòng)物乳寡糖種類和含量具有巨大的差異性，該方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，更重要的是采用在線的前處理方法避免了繁瑣的離線SPE處理過(guò)程，同時(shí)提高了方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性[12]。

圖2 在線SPE-HILIC-MS分析的示意圖[12]Fig.2 Schematic illustration of the online SPE-HILIC-MS[12].

除了上述幾種常用的前處理方法，也有用膜分離技術(shù)等實(shí)現(xiàn)蛋白和乳糖去除，Karina等[13]使用納濾膜技術(shù)對(duì)牛乳中的3’-SL、6’-SL和N-乙酰半乳糖胺化乳糖進(jìn)行了富集，采用不同種類、分子量的膜對(duì)寡糖富集效果進(jìn)行了考察，實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)級(jí)放大到工業(yè)級(jí)的轉(zhuǎn)化。Antonio等[14]采用兩步膜技術(shù)對(duì)山羊乳寡糖進(jìn)行純化和富集，先采用超濾膜(截留分子量50 kDa)將大部分蛋白去除，然后，透過(guò)液采用納濾膜(截留分子量1 kDa)除去鹽、乳糖及小分子量的可溶性蛋白，得到的截留液即為寡糖餾分，最后使用HPAEC-PAD對(duì)山羊乳中的寡糖進(jìn)行Profiling分析。膜分離技術(shù)在一定程度上存在乳糖去除不完全以及寡糖損失等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。

2 人乳寡糖的分離分析方法

近年來(lái)隨著研究者們對(duì)人乳寡糖的關(guān)注度增加，分離分析方法的報(bào)道也越來(lái)越多，如高pH陰離子交換色譜、石墨化碳液相色譜、親水作用色譜、反相色譜、毛細(xì)管電泳等，本文就上述幾種常用技術(shù)進(jìn)行分別介紹。

2.1 高pH陰離子交換色譜(high pH anion exchange chromatography, HPAEC)

低聚糖是一種以半縮醛或半縮酮形式存在的多羥基醛或酮。在強(qiáng)堿性條件下, 會(huì)部分或全部以陰離子形式存在，從而在陰離子交換柱上被保留并得到分離。然而，傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)的離子交換色譜柱在強(qiáng)堿條件下非常不穩(wěn)定，因而限制了其使用。近年來(lái)，發(fā)展的聚合物基質(zhì)的離子交換色譜柱，在廣泛的pH范圍內(nèi)，具有較高的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性，促進(jìn)了高效分離低聚糖和相關(guān)化合物技術(shù)的發(fā)展。HPAEC與脈沖安培檢測(cè)器(pulsed amperometric detector, PAD)聯(lián)用，其方法具有高分辨率、高選擇性和低檢測(cè)限的特點(diǎn)，該方法已被廣泛應(yīng)用于母乳寡糖的定性和定量分析，尤其是對(duì)寡糖異構(gòu)體的分離[15～19]。寡糖經(jīng)過(guò)凝膠柱將中性和酸性人乳寡糖預(yù)分離并去除乳糖后，采用HPAEC-PAD方法進(jìn)行寡糖單體的分離分析，尤其是寡糖異構(gòu)體可以得到很好的分離，該方法常用于對(duì)高含量的人乳寡糖進(jìn)行定性定量分析。Thurl 等[15]使用HPAEC方法研究了不同人群和不同哺乳期寡糖含量變化情況，針對(duì)14種中性寡糖和6種非巖藻糖化的酸性寡糖進(jìn)行分析，并利用德國(guó)哺乳期婦女3～90 d的母乳樣本考察了哺乳不同時(shí)期和母親血型對(duì)寡糖含量的影響。雖然HPAEC-PAD對(duì)人乳寡糖具有很好地分離選擇性，但由于其前處理過(guò)程較為繁瑣，并且其流動(dòng)相體系不能直接和質(zhì)譜聯(lián)用，只能借助標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)寡糖定性，一定程度上限制了 HPAEC的應(yīng)用。

2.2 石墨化碳液相色譜(porous graphitized carbon chromatography, PGC)

石墨化碳液相色譜是一種常用于分離寡糖和糖結(jié)合物的分離方法，石墨化碳材料對(duì)寡糖能夠很好地保留以及分離選擇性，尤其是寡糖異構(gòu)體。同時(shí)，PGC對(duì)還原性寡糖的α和β差向異構(gòu)化也能夠很好地區(qū)分，然而，這種分離容易導(dǎo)致圖譜的復(fù)雜性，是不需要的分離性能，因此通常在PGC柱分離前，需要將還原性寡糖先進(jìn)行還原。

Lebrilla和他的合作者廣泛的將PGC用于HMOs的分析。他們發(fā)展了基于PGC前處理方法和HPLC PGC Chip/TOF MS的標(biāo)準(zhǔn)流程用于母乳寡糖的Profiling分析[11]。整個(gè)過(guò)程如下：母乳通過(guò)低溫離心脫脂，有機(jī)溶劑沉淀除蛋白，得到脫脂除蛋白的母乳寡糖樣品，使用硼氫化鈉還原后，無(wú)孔石墨化碳SPE柱凈化脫鹽，得到母乳寡糖總餾分或母乳寡糖分級(jí)的餾分，再進(jìn)行HPLC PGC Chip/TOF MS分析。同時(shí)，基于保留時(shí)間、精確分子量和質(zhì)譜碎片信息，建立了一個(gè)包含40個(gè)中性寡糖和30個(gè)酸性寡糖的人乳寡糖數(shù)據(jù)庫(kù)[20,21]。該方法廣泛用于各種人乳寡糖輪廓分析中，如對(duì)不同哺乳期[22]、早產(chǎn)母親[23]及分泌類型[24]，以及其他動(dòng)物乳寡糖分析中，如靈長(zhǎng)類[25]、豬[26]、牛[27,28]等。PGC-MS方法不僅應(yīng)用于寡糖輪廓分析中，很多學(xué)者也利用此開(kāi)展了人乳寡糖絕對(duì)定量分析[29,30]。鑒于人乳寡糖標(biāo)準(zhǔn)品難于獲取，寡糖間性質(zhì)接近，Lebrilla實(shí)驗(yàn)室采用少量標(biāo)準(zhǔn)品擬合虛擬標(biāo)準(zhǔn)曲線借此對(duì)其他寡糖定量分析，開(kāi)展了對(duì)20個(gè)人群樣本的49個(gè)寡糖的分析[31]。

2.3 親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)

親水作用方法是解決極性化合物保留與分離的常用方法[32]，采用極性固定相和水溶性有機(jī)溶劑(主要為乙腈) -水為流動(dòng)相，為強(qiáng)極性化合物如糖類化合物的分離分析提供了一個(gè)很好的選擇。作為一種新型的色譜分離手段，HILIC克服了正相色譜和反相色譜在極性化合物分離過(guò)程中的不足，同時(shí)能夠提供與反相色譜截然不同的分離選擇性。此外，由于其流動(dòng)相含有高濃度的有機(jī)溶劑，有利于增強(qiáng)電噴霧離子源質(zhì)譜的離子化效率進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度，與質(zhì)譜具有很好的兼容性。然而，HILIC用于人乳寡糖的分析還相對(duì)較少[33], 目前多用于動(dòng)物乳寡糖分析[34～40]。一般在進(jìn)行HILIC分析時(shí)，會(huì)對(duì)寡糖進(jìn)行衍生化處理，來(lái)改善峰型、分離選擇性(尤其是異構(gòu)體)及檢測(cè)靈敏度。2-氨基苯甲酰胺(2-AB)是應(yīng)用較為廣泛的衍生化試劑，Benet等[41]發(fā)展了一種在線去除剩余衍生化試劑的親水色譜方法分析人乳寡糖，并將該方法用于對(duì)中國(guó)城市(北京、廣州、蘇州)母乳樣本中的10種2-AB標(biāo)記的HMOs進(jìn)行了定量分析[42]，在最近的報(bào)道中他們用麥芽三糖作為內(nèi)標(biāo)物將檢測(cè)的人乳寡糖的數(shù)量從10種擴(kuò)展到20種[43]。

2.4 毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)及其他方法

毛細(xì)管電泳具有較高的分離能力和靈敏度，常被作為糖類化合物的分離和鑒定的一種有效分離工具[44～46]，結(jié)合熒光或者紫外檢測(cè)器應(yīng)用于衍生化的人乳寡糖分析中，也有研究者將其與質(zhì)譜結(jié)合進(jìn)行人乳和嬰兒糞便中寡糖的檢測(cè)。由于其分析的樣品要求帶有電性，所以較適用于唾液酸化寡糖的分析。Newburg[47,48]發(fā)展了一種CE-UV(205 nm)方法，并將其用于分離、鑒定和定量人乳中12種未標(biāo)記的唾液酸化寡糖，結(jié)果顯示具有較好的異構(gòu)體分離效果。Monti等[49]利用相似的方法分析了不同動(dòng)物(牛、羊和馬)乳中唾液酸化寡糖。對(duì)于中性寡糖，由于不帶電荷，不能直接進(jìn)行CE分離，一般需要使用攜帶負(fù)電荷的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)物質(zhì)進(jìn)行衍生化，而唾液酸化寡糖進(jìn)行衍生化后可以改善分析選擇性和檢測(cè)靈敏度，例如Galeotti團(tuán)隊(duì)[50]將寡糖使用2-aminoacridone進(jìn)行衍生化后，采用CE-UV(254 nm)對(duì)人乳中17種中性和酸性寡糖進(jìn)行了表征，一些寡糖異構(gòu)體，如LST a、LST b和LST c，2’-FL和3-FL，LNFP I、LNFP II和 LNFP III能夠被很好地分離。CE結(jié)合MS，不僅能夠獲得很好地分離，也能夠獲得寡糖的結(jié)構(gòu)信息，包括寡糖異構(gòu)體，可以用于人乳寡糖定量及輪廓分析。

除上述方法外，其他方法例如衍生化后的寡糖也可以經(jīng)過(guò)反相色譜[51～53]進(jìn)行分離，但是反相色譜對(duì)于寡糖異構(gòu)體分離能力有限，使其應(yīng)用受到了一定的限制。紙色譜、薄層色譜[54,55]和尺寸排阻色譜[56,57]是較早用于母乳寡糖分離分析的方法，這些方法在分離效率、檢測(cè)靈敏度和異構(gòu)體分離選擇性上都存在一定的局限，現(xiàn)在已經(jīng)逐漸被色譜柱與檢測(cè)器聯(lián)用方法所取代。

3 人乳寡糖結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)研究

糖類分子的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，人乳寡糖的結(jié)構(gòu)分析包括單糖組成分析、寡糖序列分析、巖藻糖和唾液酸修飾位點(diǎn)分析。20世紀(jì)80年代末期，基質(zhì)輔助激光解析和電噴霧技術(shù)的發(fā)明，使有機(jī)質(zhì)譜獲得了突破性的進(jìn)展，擴(kuò)大了質(zhì)譜的應(yīng)用范圍，也給糖類化合物的結(jié)構(gòu)分析帶來(lái)了較大的進(jìn)展。核磁共振技術(shù)是化合物精確結(jié)構(gòu)解析的最常用手段，但是受限于人乳寡糖單體獲取較為困難，核磁共振技術(shù)需要的樣品量較大，在一定程度上限制了其應(yīng)用，本文就上述兩種鑒定技術(shù)在人乳寡糖結(jié)構(gòu)鑒定中應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了介紹。

3.1 基于質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)構(gòu)表征

基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)除具有高靈敏度、快速、準(zhǔn)確、高通量、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn)外，同時(shí)還能耐受樣品中不揮發(fā)性鹽，不需要進(jìn)行脫鹽處理，簡(jiǎn)化了樣品的操作過(guò)程。在離子化過(guò)程中，不易引起源內(nèi)裂解，而形成準(zhǔn)分子離子峰或準(zhǔn)分子離子加和峰，可用于對(duì)人乳寡糖的單糖組成進(jìn)行推斷，也可以用于大量樣本中快速的profiling分析。Berndt等[58]采用MALDI-MS對(duì)人乳中非衍生化的寡糖餾分進(jìn)行了分析，在人乳中發(fā)現(xiàn)了聚合度大于20的酸性寡糖和聚合度大于35的中性寡糖，這些高聚合度寡糖的發(fā)現(xiàn)拓展了人們對(duì)人乳寡糖組成的認(rèn)識(shí)。Kunz等[59]使用MALDI Q-TOF MS/MS方法，對(duì)大量母乳樣本中寡糖種類進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片建立碎片結(jié)構(gòu)與血型關(guān)系，從而開(kāi)展高通量快速的樣本輪廓分析。但MALDI-MS僅能給出糖的組成信息，不能夠給出具體的連接位置及連接鍵信息，因此無(wú)法用于精確結(jié)構(gòu)判斷。

電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)技術(shù)的出現(xiàn)，是生物大分子測(cè)定技術(shù)的重要突破。ESI顯著優(yōu)點(diǎn)是被分析物可以帶多電荷，從而大大擴(kuò)展了質(zhì)譜的質(zhì)量測(cè)定范圍，不僅如此，電噴霧質(zhì)譜的二級(jí)碎片結(jié)構(gòu)還可以給出寡糖的連接順序和連接鍵構(gòu)型信息，因此常用于母乳寡糖定性定量分析及結(jié)構(gòu)表征。Chai等[60,61]采用ESI-MS/MS負(fù)離子模式分別對(duì)人乳中中性和酸性寡糖進(jìn)行質(zhì)譜斷裂規(guī)律表征，在這種模式下，寡糖不需要進(jìn)行衍生化，就能夠得到異構(gòu)體的特征碎片信息，依據(jù)此可以鑒定唾液酸、巖藻糖的取代位置和寡糖的連接方式。Pfenninger等[62,63]對(duì)寡糖斷裂規(guī)律進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。與中性寡糖相比，酸性寡糖的唾液酸基團(tuán)在二級(jí)碎裂中容易脫落，由此產(chǎn)生的唾液酸碎片離子的信號(hào)強(qiáng)度非常高，與之相比，其他特征碎片的信號(hào)強(qiáng)度弱，給結(jié)構(gòu)鑒定尤其是異構(gòu)體的鑒定帶來(lái)一定的難度。近期，郎銀芝等[64]通過(guò)ESI-MSn方法對(duì)人乳寡糖高含量的8種酸性寡糖的解析進(jìn)行了詳細(xì)的介紹，為其他唾液酸寡糖的解析提供了參考。

3.2 核磁共振技術(shù) (nuclear magnetic resonance,NMR)

核磁共振技術(shù)是20世紀(jì)中期發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，給糖結(jié)構(gòu)解析工作帶來(lái)了很多方便，特別是二維核磁共振技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展, 使得 NMR 成為糖類結(jié)構(gòu)解析的重要工具，在解決糖類化合物的糖苷鍵構(gòu)型、糖的種類、糖殘基數(shù)目、糖與糖的連接位置、糖與糖的連接順序等方面具有重要的作用。NMR不需要標(biāo)準(zhǔn)品即可進(jìn)行定性分析，這對(duì)于母乳寡糖中新的未知的糖定性分析具有顯著地優(yōu)勢(shì)，但它對(duì)化合物的純度要求較高，重量需在毫克級(jí)以上，在用NMR對(duì)化合物進(jìn)行定性前，一般需要對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離純化。Chai等[65]結(jié)合ESI-MS和核磁共振技術(shù)對(duì)聚合度為10的不同人乳寡糖異構(gòu)體進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，他們還采用相同的方法對(duì)一個(gè)聚合度為12的寡糖新結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。

4 展望

盡管近年來(lái)人乳寡糖已建立較多的分析方法，從最開(kāi)始的凝膠色譜和紙色譜相結(jié)合的方法，到高效陰離子交換色譜、毛細(xì)管電泳色譜，以及以石墨化碳為代表的反相色譜方法，這些研究多數(shù)以表征寡糖含量為目標(biāo)，因此只是得到了寡糖的含量信息而沒(méi)有獲得高純度的單體寡糖樣品。與此同時(shí)，受限于人乳寡糖單體樣品的獲取問(wèn)題，許多生物功能難于深入開(kāi)展研究。而目前人乳寡糖單體尚缺少系統(tǒng)的制備方法，這與寡糖的分離方法局限和分離效率不高存在一定的關(guān)系，因此，人乳寡糖的分離純化技術(shù)方面仍有較大的空間需要繼續(xù)研究和探索。

謹(jǐn)以此文致敬中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所七十華誕(1949-2019)!