林玲 王會河 羅元

[摘要] 目的 觀察腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Mta1（metastasis associated gene 1）及其蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，并探討其臨床意義。 方法 對86例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織和20例頭頸部正常組織用逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）方法檢測Mta1 mRNA表達(dá)，用免疫組化檢測Mta1蛋白表達(dá)。 結(jié)果 Mta1 mRNA在86例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中平均表達(dá)水平（1.72±0.56）%與頭頸部正常組織（0.93±0.68）%比較，差異具有顯著性（P<0.01）；Mta1蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織陽性率（65.12%，56/86）與對照組（15%，3/20）比較，差異具有顯著性（P<0.01）。Mta1 mRNA及其蛋白在下咽癌、鼻咽癌、頸部皮膚鱗癌、淋巴結(jié)癌、扁桃體癌中平均表達(dá)水平及陽性率分別與頭頸部正常組織比較，差異具有顯著性（P<0.01）；Mta1 mRNA及蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及陽性率與高分化、中分化及低分化等分化程度呈正相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 Mta1 mRNA及其蛋白表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，提示該基因可成為預(yù)測頭頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后有價值的指標(biāo)之一。

[關(guān)鍵詞] 頭頸部腫瘤；腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移；Mta1基因；Mta1蛋白；RT-PCR；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R735.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）21-0041-03

[Abstract] Objective To observe the expression of Metastasis Associated Gene （Mta1） and its protein in head and neck squamous cell carcinoma and its clinical significance. Methods Mta1 mRNA expression was detected by reverse transcription-PCR （RT-PCR） in 86 head and neck squamous cell carcinoma tissues and 20 normal head and neck tissues. The expression of Mta1 protein was detected by immunohistochemistry. Results The average expression level of Mta1 mRNA in 86 cases of head and neck squamous cell carcinoma was （1.72±0.56） compared with （0.93±0.68） in head and neck tissues. The difference was statistically significant（P<0.01）. The positive rate of Mta1 protein in squamous cell carcinoma of the head and neck （65.12%， 56/86） was significantly higher than that of the control group （15%， 3/20） （P<0.01）. The expression and positive rate of Mta1 mRNA and its protein in hypopharyngeal carcinoma， nasopharyngeal carcinoma， neck cutaneous squamous cell carcinoma， lymph node carcinoma， and tonsillar carcinoma were significantly different from those of normal tissues of head and neck， respectively（P<0.01）. The expression and positive rate of Mta1 mRNA and protein in head and neck squamous cell carcinoma were positively correlated with the degree of differentiation of well differentiated， moderately differentiated and poorly differentiated（P<0.05）. Conclusion The expression of Mta1 mRNA and its protein is closely related to the invasion and metastasis of head and neck squamous cell carcinoma， suggesting that this gene may be useful for predicting the metastasis and prognosis of head and neck squamous cell carcinoma.

[Key words] Head and neck neoplasms； Tumor invasion and metastasis； Mta1 gene； Mta1 protein； RT-PCR； Immunohistochemistry

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率高，約為15/10萬左右，占全身惡性腫瘤的16%～40%，在全身惡性腫瘤中其排第六位[1-2]。其發(fā)病率和病死率呈逐年增高趨勢，嚴(yán)重影響人們的身體健康。雖然對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行了大量的綜合治療和基礎(chǔ)研究，但總的療效仍不滿意。為了解Mta1及其蛋白表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本實驗采用RT-PCR技術(shù)、免疫組化，檢測了基因Mta1及其蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月～2017年7月年在廣西醫(yī)科大學(xué)附第一醫(yī)院及第二醫(yī)院耳鼻咽喉科取新鮮手術(shù)標(biāo)本。實驗組為86例頭頸部惡性腫瘤組織，對照組為20例正常頭頸部組織，86例頭頸部惡性腫瘤標(biāo)本經(jīng)病理檢查均證實為鱗狀細(xì)胞癌，20例對照組標(biāo)本病理證實為正常組織，比較基因Mta1在癌組織和正常組織的表達(dá)。86例頭頸部惡性腫瘤組織包括40例鼻咽癌，27例下咽癌，9例頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，7例頸部皮膚鱗癌，3例扁桃體癌。其中11例為高分化鱗癌，25例為中分化鱗癌，50例為低分化鱗癌。男60例，女26例，年齡在30～78歲，平均年齡56.33歲。對照組20例：男12例，女8例，年齡19～65歲，平均年齡43.61歲。

1.2 方法

（1）總RNA的提取、鑒定：取冰凍組織50 mg加入Trizol試劑1 mL，在冰浴中勻漿，按Trizol試劑（Invitrogen產(chǎn)品）說明操作提取總RNA?？俁NA A260 mm/A280 m=1.8，純度符合要求，為完整性總RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid TM Fermentas產(chǎn)品）操作。反應(yīng)體系：2.0 μg總RNA，1 μL隨機引物，2 μL 10 mM dNTP，1 μL RNA酶抑制劑，4 μL 5X buffer，12 μL純水，1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶。25℃水浴10 min，42℃水浴60 min，70℃水浴10 min。得到的cDNA冰浴后備用。（3）PCR檢測： 基因上下游引物：β2微球蛋白（內(nèi)參照）為5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'，5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'（上海生工產(chǎn)品）；Mta1為5'-CACGCTTGGTTTCCGAGGAT-3'，5'-AGCTACGAGCAGCACAACGGGGT-3'，（上海生工產(chǎn)品）。采用PCR擴增試劑盒（SK2492 上海生工產(chǎn)品），反應(yīng)體系為模板DNA 5 μL，Mta1基因引物（上、下游）10 μmol/L各0.8 μL，β2微球蛋白引物各1 μL，2 mM dNTP 5 μL，10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCL2 5 μL，5 μ/μL Taq酶0.6 μL，2dH2O 25.8 μL，總體積為50 μL在MJ PTC-220 PCR儀循環(huán)。擴增反應(yīng)條件：變性94℃ 60 s，退火58℃ 60 s，延伸72℃ 120 s，循環(huán)35次，最后一個周期延伸5 min。PCR半定量：取5 μL PCR產(chǎn)物置于2.3%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下觀察結(jié)果。采用UVP自動凝膠圖象分析系統(tǒng)測量Mta1（289 bp）及β2微球蛋白（118 bp）的吸光度值（A值），每例標(biāo)本的相對A值等于Mta1A值和β2微球蛋白A值的比值。（4）免疫組化：采用福州邁新公司生產(chǎn)的即用型非生物素免疫組化EliVision plus檢測試劑盒和美國SantaCruz公司生產(chǎn)的兔抗人Mta1蛋白單克隆抗體，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行EliVision plus法染色。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為Mta1蛋白陽性[3]，根據(jù)著色強度和陽性細(xì)胞數(shù)來綜合判斷，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分；0分：無色、1分：淺黃色、2分：棕黃色。著色強度和陽性細(xì)胞數(shù)兩項之積≤3分為陰性，3～4分為陽性，>4分為強陽性。PBS代替一抗為陰性對照。兩位病理科醫(yī)師用雙盲法分別觀察每例切片，意見一致的結(jié)果為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，采用Pearson分析方法進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mta1 mRNA及蛋白在對照組和實驗組中的表達(dá)

Mta1 mRNA及蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、頭頸部正常組織中均具有不同程度的表達(dá)。Mta1相對A值及蛋白陽性率見表1。RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖譜見封三圖5。Mta1蛋白陽性表達(dá)見封三圖6。

2.2 Mta1 mRNA及蛋白在對照組、鼻咽癌、下咽癌、皮膚鱗癌、淋巴結(jié)癌及扁桃體癌的表達(dá)

Mta1 mRNA 及蛋白在鼻咽癌、下咽癌、皮膚鱗癌、淋巴結(jié)癌及扁桃體癌中的平均表達(dá)水平及陽性率分別明顯高于正常頭頸部組織，見表2。

2.3 Mta1 mRNA及蛋白表達(dá)與頭頸部鱗癌分化程度的關(guān)系

Mta1 mRNA及蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及陽性率與高分化、中分化及低分化等分化程度呈正相關(guān)（P<0.05）。見表3。

3 討論

基因Mta1（metastasis associated gene 1）是與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因家族成員之一，最初從鼠乳腺癌細(xì)胞株中分離出來，被命名為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[4-6]。Mta1在人正常組織中表達(dá)水平低，而在人乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胃腸癌、食管癌、胰腺癌等癌組織中呈高表達(dá)水平。大量文獻(xiàn)報道，基因Mta1與人惡性腫瘤組織浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[7-13]。本實驗結(jié)果顯示，Mta1 mRNA在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中平均表達(dá)水平明顯高于頭頸部正常組織，Mta1蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率與頭頸部正常組織比較，其差異均具有顯著性（P<0.01）。Mta1 mRNA在下咽癌、鼻咽癌、頸部皮膚鱗癌、淋巴結(jié)癌、扁桃體癌中的平均表達(dá)水平分別明顯高于正常頭頸部組織，Mta1蛋白在下咽癌、鼻咽癌、頸部皮膚鱗癌、淋巴結(jié)癌、扁桃體癌中的陽性表達(dá)率分別與正常頭頸部組織比較，其差異分別有顯著性（P<0.01）。本實驗結(jié)果和文獻(xiàn)報道一致，結(jié)果顯示Mta1 mRNA在正常組織中表達(dá)水平低或不表達(dá)，而在下咽癌、鼻咽癌、頸部皮膚鱗癌、淋巴結(jié)癌、扁桃體癌等頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平明顯增高，并且其蛋白表達(dá)陽性率也隨之明顯增高，Mta1 mRNA及其蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)具有一致性，說明基因Mta1與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示基因Mta1及基因產(chǎn)物在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用。

研究證實人Mta1蛋白含有一鋅指DNA結(jié)合域Cys-X2-Cys-X17Cys-X2-Cys和許多SPXX域，這些結(jié)構(gòu)多見于基因結(jié)合蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，參與了控制細(xì)胞分化和生長的信號傳導(dǎo)途徑的重要組成。本研究結(jié)果還顯示，Mta1 mRNA及蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及陽性率與高分化、中分化及低分化等分化程度成正相關(guān)（P<0.05），在高分化、中分化及低分化鱗狀細(xì)胞癌中平均表達(dá)水平及陽性率均不同，并在高分化、中分化及低分化病理分級中隨著其惡性程度的增高，Mta1 mRNA的表達(dá)水平及其蛋白陽性率都隨之明顯增高，在低分化鱗癌中Mta1 mRNA的表達(dá)水平及其蛋白陽性率都是最高值。說明Mta1 mRNA的表達(dá)水平及其蛋白陽性率與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的惡性程度具有密切相關(guān)系。提示在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，Mta1基因及產(chǎn)物可能在信號傳導(dǎo)路徑中發(fā)揮重要作用[6]。

基因Mta1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中的確切作用機制，目前仍不明確。但本研究結(jié)果表明，基因Mta1在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平的表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)[14，15]。Mta1基因雖然不是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌特異性的指標(biāo)，但頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中Mta1蛋白的陽性表達(dá)可為判斷頭頸部鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后提供可能的資訊。

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（收稿日期：2018-03-26）