徐志偉，徐一然，陳永霞，劉偉忠，徐小波，于建寧

（1江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容212400；2江蘇大學(xué)土木工程與力學(xué)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212000；3江蘇省句容市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇句容212400；4江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所，南京210014）

0 引言

載脂蛋白(Apolipoprotein,Apo)是來(lái)源于血漿脂蛋白中的蛋白[1]，具有穩(wěn)定脂蛋白的功能，并通過(guò)修飾與脂代謝有關(guān)的酶活性影響脂肪代謝[2-4]。ApoB與膽固醇共同組成低密度脂蛋白(LDL)，能夠識(shí)別LDL受體，參與LDL代謝過(guò)程[5-8]，所以ApoB對(duì)保持體內(nèi)恒定的血脂水平和介導(dǎo)體內(nèi)脂類(lèi)代謝必不可少?；诖?，人ApoB的檢測(cè)在急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、糖尿病等心血管疾病的診斷及后期臨床治療等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值[9-10]。測(cè)定ApoB能夠直接反映低密度脂蛋白的水平，它與Apoa1的比值是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病預(yù)測(cè)和診斷的重要指標(biāo)。

在動(dòng)物生物技術(shù)中，免疫血清制備是一項(xiàng)常用的技術(shù)。通過(guò)制備高效價(jià)、高特異性的免疫血清可以為免疫學(xué)診斷提供試劑，亦可用于醫(yī)學(xué)上特異性免疫治療或者相關(guān)醫(yī)療研究。免疫血清的制備也是科研院所免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要內(nèi)容，是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室必不可少的生物制劑。然而目前通過(guò)免疫大動(dòng)物獲得免疫血清中的抗體效價(jià)并不理想，如何提高抗體效價(jià)，是拓寬免疫血清應(yīng)用的主要限制因素之一。本試驗(yàn)研究通過(guò)免疫湖羊不同劑量的ApoB抗原，分析湖羊生產(chǎn)羊抗人血清的效果，通過(guò)抗體效價(jià)、抗體產(chǎn)生規(guī)律和ApoB產(chǎn)品性能檢測(cè)，獲得最佳抗原注射量，為規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為增加傳統(tǒng)畜牧養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)收益提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)羊：在句容市行香羊場(chǎng)選擇健康羊只，年齡10月～1.5周歲，體重40 kg左右湖羊公羊。為利于羊身體健康、試驗(yàn)獲得好的效果，對(duì)實(shí)驗(yàn)羊群采用放牧加舍飼的飼養(yǎng)方法，白天放牧4 h（上、下午各2 h），晚上飼喂精料一次，半個(gè)月后開(kāi)始試驗(yàn)。

試驗(yàn)抗原：ApoB抗原購(gòu)自上海元升生物科技有限公司，純度96%。

免疫佐劑：完全弗氏與不完全弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)分組：將30只湖羊隨機(jī)分成3組，每組10只，打上耳標(biāo)，抗原量分別為組1每次0.2 mg，組2每次0.4 mg，組3每次1.0 mg。

免疫方式：皮下多點(diǎn)注射，注射點(diǎn)分別為腹股溝3個(gè)點(diǎn)、肘部2個(gè)點(diǎn)、頜下1個(gè)點(diǎn)、背側(cè)2個(gè)點(diǎn)、耳后1個(gè)點(diǎn)，兩側(cè)共計(jì)16個(gè)點(diǎn)。

免疫程序：共計(jì)5次免疫。以組1為例，說(shuō)明免疫程序。

初免：抗原1 mL(2 mg/mL)+9 mL PBS混勻后，與等量10 mL完全弗氏佐劑充分乳化后免疫羊，按16個(gè)點(diǎn)均勻注射。第二次免疫為間隔15天后，抗原1 mL(2 mg/mL)+9 mL PBS混勻，與等量10 mL不完全弗氏佐劑充分乳化后免疫羊，按16個(gè)點(diǎn)均勻注射。隨后進(jìn)行3次免疫，每次間隔7天，將抗原1mL(2mg/mL)+9 mL PBS混勻后，與等量10 mL不完全弗氏佐劑充分乳化后免疫羊（按16個(gè)點(diǎn)均勻注射）。

組2中抗原2 mL(2 mg/mL)+8 mL PBS混勻，組3中5 mL(2 mg/mL)+5 mL PBS混勻，免疫程序與組1相同，共免疫5次，每次按16個(gè)點(diǎn)均勻注射。

免疫羊觀察：每天觀察羊的動(dòng)態(tài)，采食情況，精神狀況，做好記錄。

抗體檢測(cè)：隨機(jī)在3個(gè)組合中各挑出5只羊，共15只羊，在免疫前、二免前、三免前、五免后5天分別采血進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)，做好記錄。

1.3 血清制備

待血液凝固之后，在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌滴管把血塊剝離瓶壁，37℃放置1～2 h，放入4℃過(guò)夜，血清充分析出后經(jīng)離心沉淀分離出血清，放進(jìn)低溫冰箱保存。

1.4 抗血清效價(jià)測(cè)定

抗血清效價(jià)采用常規(guī)的瓊脂擴(kuò)散方法。設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔和陰性孔，主要步驟為瓊脂板的配制、打孔、補(bǔ)底和加樣。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用分析軟件SPSS 17.0進(jìn)行ANOVA分析，作圖SigmaPlot 10.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫羊抗體效價(jià)

血清中檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果（表1）顯示：第一次免疫后15天，即第二次免疫前，0.2 mg組抗體效價(jià)平均為在1:25.4，隨后逐漸升高到1:28.0；0.4 mg組抗體效價(jià)明顯高于其他2組，五免后的抗體效價(jià)能夠達(dá)到1:28.8；而1.0 mg組抗體效價(jià)的整體水平與0.2 mg組較為接近。但3組五免后的抗體效價(jià)均達(dá)到后續(xù)用于制備檢測(cè)試劑盒或者其他醫(yī)學(xué)用途的抗體水平。

表1 免疫后ApoB多抗血清效價(jià)比較

2.2 免疫羊抗體產(chǎn)生規(guī)律

圖1 不同免疫抗原濃度的抗體效價(jià)趨勢(shì)圖

從圖1中可以看出，隨著免疫次數(shù)的增加，血清中抗體效價(jià)逐步升高，到五免后抗體效價(jià)能夠升高到1:26～1:28；而且圖中顯示0.4 mg組從二免前一直到五免后的抗體效價(jià)都要顯著高于其他兩組，提示最佳的免疫原注射量為0.4 mg/次。注射量較少(0.2 mg)或者較多(1.0 mg)都不利于血清中抗體濃度的升高。

2.3 ApoB產(chǎn)品性能的檢測(cè)

為了后續(xù)制備試劑盒的需要，對(duì)血清中的ApoB抗體進(jìn)行了產(chǎn)品性能的檢測(cè)，見(jiàn)表2。從外觀上看，試劑應(yīng)為無(wú)色透明液體，檢驗(yàn)結(jié)果符合；試劑分析的靈敏度為0.262 ΔA/(g·L)，合格；試劑空白吸光度≤0.030，符合要求；試劑的準(zhǔn)確度亦符合要求。由此可見(jiàn)通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的免疫程序能夠成功生產(chǎn)出符合后續(xù)試劑盒要求的抗體。

表2 ApoB產(chǎn)品性能的檢測(cè)

3 討論

諸多研究表明，ApoB對(duì)于醫(yī)學(xué)診斷及疾病治療具有重要作用。在臨床上，檢測(cè)載脂蛋白A(ApoA)與載脂蛋白B(ApoB)對(duì)血脂的判斷具有重要意義[8-9]。由于ApoB在體內(nèi)脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝以及維持血脂水平的恒定中所起的核心作用，所以ApoB的基因變異可能與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病有必然聯(lián)系[8,11-12]。另一方面，測(cè)定脂蛋白及載脂蛋白對(duì)這些疾病發(fā)生狀態(tài)的跟蹤與分析意義重大[9,13]。但目前用于檢測(cè)ApoB的試劑盒尚不成熟。

目前抗血清的商業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用馬、綿羊和山羊等大型家畜，這類(lèi)家畜具有壽命長(zhǎng)、易管理、靜脈采集血液方便等優(yōu)點(diǎn)[10,14]。制備高效價(jià)的免疫血清的主要影響因素有抗原自身性質(zhì)、抗原的注射劑量、注射次數(shù)、間隔時(shí)間、注射途徑及抗原佐劑等[15-17]。免疫劑量的不同導(dǎo)致對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激強(qiáng)弱存在差異，從而產(chǎn)生不同水平的抗體，進(jìn)而影響免疫血清的效價(jià)[18-20]。本試驗(yàn)從免疫原的注射劑量入手，對(duì)免疫劑量進(jìn)行優(yōu)化，不但進(jìn)一步增高了抗體的效價(jià)，而且節(jié)省了抗原用量，降低了生產(chǎn)成本。

從抗體產(chǎn)生的規(guī)律看，3種劑量的抗原都能夠產(chǎn)生ApoB抗體，生產(chǎn)趨勢(shì)一致；抗體表達(dá)量以每次0.4 mg的免疫劑量注射時(shí)最高，并非我們預(yù)猜測(cè)的免疫抗原越多越好。為了下一步做檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)了ApoB的產(chǎn)品性能，從外觀、靈敏度、吸光度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，達(dá)到預(yù)期水平，可用于后期的商業(yè)化生產(chǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)收益。

綜上所述，本試驗(yàn)形成了一套制備ApoB抗血清的生產(chǎn)流程，從免疫的具體程序、免疫原劑量的優(yōu)化到產(chǎn)品性能的檢測(cè)，具有可重復(fù)性，可以在一定范圍內(nèi)加以推廣。