馬琪林 井初雅 呂哲 鄭良城 洪甘濟 方杰

組織蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)基因, 位于11號染色體, 可編碼形成功能蛋白 CTSD［1］。有文獻報道, CTSD基因224 處 C～T ［Ala～Val］多 態(tài) 與 阿 爾 茨 海 默 病 (alzheimer’s disease, AD)相關(guān), 攜帶CTSD-T等位基因的個體比不攜帶T等位基因的個體患AD的幾率增加了3.1倍［2］, CTSD-C/T多態(tài)性會增加晚發(fā)型AD的患病風(fēng)險［3］。在對于動脈粥樣硬化的發(fā)病機制研究中有結(jié)果顯示CTSD和NF-κB的表達有相關(guān)性［4］, 提示CTSD可能會有抑炎作用, CTSD-T突變體可能與AD中的炎癥反應(yīng)相關(guān)。本研究檢測了APP/PS1小鼠和野生型小鼠大腦內(nèi)CTSD的表達情況, 并構(gòu)建了Ctsd基因敲除小鼠, 檢測其中各類促炎和抑炎因子的表達變化, 從而研究CTSD在AD免疫機制中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Ctsd基因敲除小鼠由廣州賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建, APP/PS1小鼠和WT小鼠由廈門大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所提供, 在廈門大學(xué)實驗動物中心進行飼養(yǎng)和繁殖, 飼養(yǎng)溫度22～25℃, 空氣濕度為50%, 12 h明暗交替。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR技術(shù) 剝離小鼠腦組織, Trizol法提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 稀釋引物濃度至10 μM的工作濃度 , 按照 2 ×SYBR Green Master 5 μl；Forward primer(10 μM)0.3 μl；Reverse primer (10 μM)0.3 μl；cDNA Template 10 ng ；Nuclease-free Water up to 10 μl進行混合。將反應(yīng)板置于 Light Cycler 480熒光定量 PCR 儀中, 最后用2-△△CT方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 Western blot技術(shù) 使用解剖器械取出小鼠腦組織,裂解、勻漿后制備樣本。聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離, 將SDS-PAGE膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。電轉(zhuǎn)過后的PVDF膜用TBS/T洗膜液清洗, 封閉2 h后加入一抗溶液,4℃包被過夜。洗滌后加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液, 室溫孵育1 h。再次洗滌后用新配制的增強型化學(xué)發(fā)光劑溶液浸潤, 迅速于全自動化學(xué)發(fā)光儀曝光。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 將小鼠麻醉灌注固定后取腦, 置于4% PFA中固定6 h, 然后蔗糖梯度脫水。OCT進行包埋后15 μm冰凍切片。60℃包埋烘片60 min, 1×PBS洗3次后室溫下用預(yù)配好的封閉液封閉1 h, 在染色濕盒內(nèi)4℃孵育一抗過夜。洗滌后避光孵育熒光二抗1 h。再次洗滌后加入DAPI使細胞核著色, 洗滌后封片在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism5統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計代表3次或者以上的平均值, 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗和方差分析。p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1小鼠腦內(nèi)CTSD mRNA水平和蛋白水平明顯下降 RT-PCR結(jié)果顯示, APP/PS1小鼠大腦內(nèi)CTSD mRNA表達水平較WT小鼠明顯減少, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見圖1。Western blot顯示, APP/PS1小鼠大腦內(nèi)CTSD蛋白表達水平較WT小鼠明顯減少, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見圖2。

圖1 WT小鼠和APP/PS1小鼠中CTSD mRNA的變化, ap＜0.05

圖2 WT小鼠和APP/PS1小鼠中CTSD蛋白表達水平的變化,ap＜0.05

2.2 Ctsd敲除鼠中促炎因子表達上調(diào)、而抑炎因子表達下調(diào) 研究Ctsd敲除鼠中炎癥因子的mRNA水平發(fā)現(xiàn), 促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、中性粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的mRNA表達明顯增加。見圖3。而抑炎因子轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-4(IL-4)和白介素-10(IL-10)的mRNA表達減少。見圖4。2.3 Ctsd敲除鼠腦中NF-κB表達上調(diào) 研究Ctsd敲除鼠腦中核因子NF-κB表達的變化時發(fā)現(xiàn), NF-κB在Ctsd-/-小鼠海馬中的表達水平明顯高于Ctsd+/+小鼠。見圖5。

圖3 Ctsd+/+小鼠和Ctsd-/-小鼠中促炎因子mRNA的變化, a p＜0.05

圖4 Ctsd+/+小鼠和Ctsd-/-小鼠中抑炎因子mRNA的變化, ap＜0.05

圖5 Ctsd+/+小鼠和Ctsd-/-小鼠海馬中NF-κB表達的變化, ap＜0.05

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)CTSD能夠通過剪切淀粉樣前體蛋白參與清除Aβ、抑制其積聚纖維化和淀粉樣沉積的生成, 最終抑制AD病情惡化［5］。體外實驗表明其在酸性條件下具有類似β-和γ-分泌酶的水解活性, 能夠水解載脂蛋白E, 從而減緩AD進展［6］。免疫炎癥在AD中起著重要作用［7,8］, CTSD基因突變可提高AD的患病風(fēng)險, 另外CSTD冠心病模型中已被證實可以調(diào)控NF-κB信號通路而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此推測CSTD可能參與了AD病程中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

本實驗首先驗證了CTSD在AD模型小鼠大腦中表達水平的改變, 證實在APP/PS1小鼠腦內(nèi), CTSD mRNA水平和蛋白水平下降。接著, 作者構(gòu)建了Ctsd敲除小鼠模型, 探究缺失CSTD小鼠與AD小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)的變化情況。實驗首次發(fā)現(xiàn), 在Ctsd敲除的老鼠中, 與神經(jīng)炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的促炎因子TNFα、IL-6和GM-CSF表達增加, 而抑炎因子TGF-β、IL-4和IL-10表達減少, 這與AD小鼠中炎癥反應(yīng)改變類似［9］。進一步我們通過免疫熒光實驗證實Ctsd敲除的老鼠大腦中, NF-κB表達水平上調(diào), 說明缺失Ctsd可激活NF-κB通路。

該結(jié)果證實了CTSD可影響與神經(jīng)炎癥反應(yīng)相關(guān)的促炎因子和抑炎因子的表達, 并且可能是通過激活NF-κB通路介導(dǎo)。但CTSD在AD的病理生理過程是通過何種方式來發(fā)揮這種作用, 仍需進一步深入研究。