文英杰，王詩隆，李林輝

（西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637009）

血橙屬混種植物，首次出現(xiàn)在1850年的歐洲，中國主要分布在四川等地，其中四川資中被稱為“塔羅科血橙之鄉(xiāng)”。血橙具有促進(jìn)血液循環(huán)、促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生的藥用價值。紅玉血橙在我國廣泛的栽培，果肉多汁細(xì)嫩并且具有玫瑰花香味[1]。塔羅科血橙是從塔羅科血橙珠心系后代中選育而成，塔羅科血橙含有豐富的VE及其他多酚化合物，具抗氧化、防止心血管疾病和抑制癌癥發(fā)生等生理作用[2-3]。然而，血橙的上市時間短暫且不耐貯存，不能周年供應(yīng)，可以把它加工成果汁飲品、濃縮汁等，其中利用橙汁釀酒也是一種有效的解決辦法，而在橙子酒釀制過程中澄清工藝是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。在血橙加工過程中，為了提高果汁出汁率、降低果汁黏稠度等需要加入果膠酶。在上世紀(jì)30年代初，國外就將果膠酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展，果膠酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化[5]。近年來，蒲海燕等人[6]不僅利用果膠酶對雪蓮果汁澄清效果的影響進(jìn)行了研究，用果膠酶對蘆薈汁[7]、香蕉汁[8]、布朗李汁[9]等果汁飲料的澄清處理，但對于果膠酶澄清血橙的研究較少。其中，牛麗影等人[10]利用果膠酶對5個不同品種的橙汁進(jìn)行酶解處理，結(jié)果表明5個品種（哈姆林、橘橙、鳳梨甜橙、錦橙、特羅維他）酶解后的澄清度分別為28.35%，26.64%，16.46%，34.96%，9.12%。研究人員利用果膠酶針對玫瑰香橙汁選出了適宜的生產(chǎn)工藝，在此適宜的工藝條件下，玫瑰香橙汁的透光率為98%。而試驗(yàn)選用的這2種不同品種的血橙是由于塔羅科血橙市場潛力大，市場份額大，紅玉血橙成熟期晚，能調(diào)節(jié)市場供應(yīng)[1]。

在對2個不同品種的血橙汁進(jìn)行預(yù)處理的基礎(chǔ)上，添加果膠酶對橙汁進(jìn)行澄清處理，主要目的是探究并確定血橙汁的澄清工藝參數(shù)，從而為后續(xù)釀酒工業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紅玉血橙、塔羅科血橙，均購于南充市；果膠酶制劑LALLZYME EX-V，購于上?？奠称凤嫎I(yè)有限公司；鉀片、檸檬酸，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 血橙汁的制備

挑選血橙并清洗干凈，然后放入沸水中漂燙2 min，再用簡易榨汁機(jī)榨汁，經(jīng)干凈紗布過濾盛于燒杯中備用。

1.2.2 果膠酶澄清橙汁的單因素條件

（1）果膠酶澄清橙汁的單因素試驗(yàn)。取剛榨出的新鮮紅玉血橙、塔羅科血橙橙汁，分別裝于6支150 mm×15 mm的試管中，每支試管裝入橙汁10 mL，加入果膠酶使其質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 g/L的果膠酶，于40℃條件下水浴反應(yīng)60 min。取出后取上清液以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，于波長680 nm處測定透光率，透光率越大者表示果汁的澄清度越高，以此確定果膠酶最適用量。每個質(zhì)量濃度設(shè)定3個重復(fù)，最終選取平均值。

（2）酶解溫度對澄清效果的影響。取剛榨出的新鮮紅玉血橙、塔羅科血橙橙汁，分別裝于6支150 mm×15 mm的試管中，每支試管裝入橙汁10 mL，分別加入0.02 g/L（塔羅科血橙為0.05 g/L）果膠酶，在20，30，40，50，60，70℃下水浴反應(yīng)60 min，取出后取上清液以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，于波長680 nm處測定透光率，同時確定果膠酶最適酶解溫度。每個酶解溫度設(shè)定3個重復(fù)，最終選取平均值。

（3）酶解時間對澄清效果的影響。取剛榨出的新鮮紅玉血橙、塔羅科血橙橙汁，分別裝于8支150 mm×15 mm的試管中，每支試管裝入橙汁10 mL，分別加入0.02 g/L（塔羅科血橙為0.05 g/L）果膠酶，準(zhǔn)備好的8支試管分別在40℃的水浴中反應(yīng)15，30，45，60，75，90，105，120 min，取出后取上清液以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，于波長680 nm處測定透光率，同上確定果膠酶最適酶解時間。每個酶解時間設(shè)定3個重復(fù)，最終選取平均值。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

（1）多因素試驗(yàn)。選取單因素試驗(yàn)時，得到的較佳酶質(zhì)量濃度和較佳的作用溫度各3個，以取上述榨出果汁為原料，以確定果膠酶處理橙汁的最佳酶質(zhì)量濃度和溫度組合，澄清試驗(yàn)時間依然為60 min，取上清液以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，測定OD680，同上確定果膠酶的最優(yōu)參數(shù)。上述澄清試驗(yàn)均做3次平行試驗(yàn)。

（2）優(yōu)化果膠酶澄清工藝試驗(yàn)。根據(jù)影響橙汁澄清效果的果膠酶用量、酶解溫度、酶解時間3個因子的水平范圍，設(shè)計出17組三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，在表1，表2中分別列出了3個因素的水平及編碼。上述澄清試驗(yàn)均做3次平行試驗(yàn)。

Box-Behnken設(shè)計試驗(yàn)因素和水平設(shè)計（紅玉血橙）見表1，Box-Behnken設(shè)計試驗(yàn)因素和水平設(shè)計（塔羅科血橙） 見表2。

1.3 果汁澄清度的測定采用分光光度法

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗(yàn)因素和水平設(shè)計（紅玉血橙）

表2 Box-Behnken設(shè)計試驗(yàn)因素和水平設(shè)計（塔羅科血橙）

澄清的上清液離心后，皇波長680 nm處測定果汁的透光率T（%），透光率越大表示果汁的澄清度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶用量的影響

果膠酶用量與透光率的關(guān)系見圖1。

由圖1可知，隨著果膠酶用量從0.01 g/L升高到0.02 g/L，血橙汁的透光率逐漸升高，由90.2%升高到97.4%，此時達(dá)到了最大的透光率。但隨著果膠酶的用量從0.02 g/L逐漸增加到0.06 g/L，血橙汁的透光率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，由97.4%減少到95.1%。而塔羅科血橙的透光率變化為在40℃條件下不同果膠酶量酶解60 min塔羅科血橙汁透光率的變化。透光率隨著果膠酶用量的增加先上升后下降；當(dāng)果膠酶用量為0.05 g/L時，透光率達(dá)到94.7%。

2.2 酶解溫度的影響

酶解溫度與透光率的關(guān)系見圖2。

由圖2可知，在不同酶解溫度下，0.02 g/L果膠酶用量酶解1 h后紅玉血橙汁與塔羅科血橙汁透光率的變化。紅玉血橙隨著酶解溫度由20℃升高到40℃，透光率也從93.8%升高到96.2%，并在酶解溫度為40℃時透光度達(dá)到96.2%這一最大值。當(dāng)酶解溫度由40℃逐漸再升高并達(dá)到70℃時，透光率整體呈現(xiàn)下降趨勢。而塔羅科血橙在不同的酶解溫度下果膠酶用量為0.02%，酶解時間60 min時塔羅科血橙汁透光率的變化。增加酶解溫度從20℃到40℃，橙汁的透光率從91.4%升高到93.2%，當(dāng)酶解溫度為40℃時透光度達(dá)到93.2%最大值。

2.3 酶解時間的影響

酶解時間與透光率的關(guān)系見圖3。

由圖3可知，在40℃溫度條件下果膠酶用量為0.02 g/L時，不同酶解時間段內(nèi)紅玉血橙汁和塔羅科血橙汁透光率的變化。透光率在整體上呈現(xiàn)升高的趨勢，但是在酶解時間達(dá)到105 min時，透光率最大為96.3%，之后隨著酶解時間的增加，透光率反而有所降低。而塔羅科血橙在40℃酶解溫度條件下果膠酶用量為0.05 g/L時，不同酶解時間段塔羅科血橙汁透光率的變化情況。增加酶解時間15～30 min，透光率急速增加，達(dá)到最大值90.2%，當(dāng)酶解時間由30 min逐漸增加到120 min，透光率開始減小。

2.4 優(yōu)化酶法澄清紅玉血橙汁工藝的試驗(yàn)

在所獲得的因素的水平范圍內(nèi)，采用三因素三水平響應(yīng)面的方法設(shè)計優(yōu)化試驗(yàn)。

試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果見表3。

由表3可知，紅玉血橙汁的最佳工藝為果膠酶用量0.02 g/L，酶解溫度50℃，酶解時間90 min。

回歸模型方差分析見表4，回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見表5。

由表4，表5可知，回歸方程及模型p=0.003 5＜0.01，表明模型的擬合程度較好；失擬項(xiàng)p=0.130 1＞0.05，差異不顯著，表明試驗(yàn)誤差較??；模型的決定系數(shù)R2=0.836 9，模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.627 3，擬合度較好，模型能夠反映響應(yīng)值變化，試驗(yàn)誤差小。表7還可以看出，根據(jù)系數(shù)估計值A(chǔ)（1.95），B（0.76），C（0.037），可知影響因子對響應(yīng)值的影響程度主效應(yīng)順序?yàn)锳＞B＞C。

表3 試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

表5 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

式中變量為編碼值。

2.5 優(yōu)化酶法澄清塔羅科血橙汁工藝的試驗(yàn)

在所獲得的塔羅科血橙的因素水平范圍內(nèi)，采用三因素三水平響應(yīng)面方法設(shè)計優(yōu)化試驗(yàn)。

試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果見表6。

由表6可知，塔羅科血橙汁的最佳工藝為果膠酶用量0.05 g/L，酶解溫度30℃，酶解時間45 min。

表6 試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果

回歸模型方差分析見表7，回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見表8。

由表7，表8可知，回歸方程及模型p=0.016 2＜0.05，表明模型的擬合程度較好；失擬項(xiàng)p=0.409 9＞0.05，差異不顯著，表明試驗(yàn)誤差較??；模型的決定系數(shù)R2=0.886 8，模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.741 3，擬合度好，模型能夠反映響應(yīng)值變化，試驗(yàn)誤差小。表10還可以看出，根據(jù)系數(shù)估計值A(chǔ)（-0.12），B（0.18），C（1.05），可知影響因子對響應(yīng)值的影響程度主效應(yīng)順序?yàn)?C′＞B′＞A′。

表7 回歸模型方差分析

表8 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

注：**表示影響極顯著，*表示顯著。

果膠酶用量、酶解溫度、酶解時間對橙汁透光率的影響見圖4。

通過Design Expert 8.0.6軟件得到響應(yīng)曲面圖和等高線。在響應(yīng)面圖中圓形等高線表示參數(shù)之間交互作用不顯著，而橢圓形或馬鞍形等高線則表示參數(shù)之間交互性較強(qiáng)。

由圖（a）、（b） 左圖可知，果膠酶用量與酶解溫度的交互作用比果膠酶用量與酶解時間的交互作用顯著。圖（a）中當(dāng)酶解時間為60 min時，隨著果膠酶用量和酶解溫度的增加，透光率升高。圖（b）中當(dāng)酶解溫度為40℃時，隨著果膠酶用量和酶解時間的增加，透光率呈先上升后下降的趨勢。圖（c）中酶解溫度和酶解時間交互作用顯著，果膠酶用量為0.02 g/L時，酶解溫度低時，酶解時間影響不大，酶解溫度高時，酶解時間越長透光率越??；酶解時間短時，酶解溫度越高透光率越大，酶解時間長時，酶解溫度越高透光率越小。

由圖（a） 右圖可知，當(dāng)酶解時間為105 min時，隨果膠酶用量和酶解溫度的增加，透光率先升高后降低。圖（b）中當(dāng)酶解溫度為40℃時，隨果膠酶用量的增加，透光率先升高后降低。由此可知，當(dāng)果膠酶用量低時，酶解時間越長透光率越大，果膠酶用量高時，時間越長則透光率越低。圖（c） 所示，果膠酶用量為0.05 g/L時，酶解溫度高時，酶解時間影響不大，酶解溫度低時，酶解時間越長透光率越大；酶解時間短時，酶解溫度越高透光率越大，酶解時間長時，酶解溫度越高透光率越小。

2.6 最佳工藝條件確定與驗(yàn)證

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件的Optimization程序中Numerical分析，可知得到紅玉血橙的最大響應(yīng)值所對應(yīng)的因素條件為果膠酶用量0.02 g/L，酶解溫度50℃，酶解時間97.59 min，模型預(yù)測得到的果汁透光率值為96.8%，實(shí)測3次得到透光率的平均值為96.1%，與理論預(yù)測吻合，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的條件準(zhǔn)確可靠。塔羅科血橙最大響應(yīng)值所對應(yīng)的因素條件為果膠酶用量0.05 g/L，酶解溫度37℃，酶解時間45 min，模型預(yù)測得果汁透光率值為95.9%，而實(shí)測3次透光率的平均值為95.7%，與理論預(yù)測吻合，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的條件準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

利用2個不同品種的橙子（紅玉血橙、塔羅科血橙）經(jīng)果膠酶處理后經(jīng)過722分光光度計對其透光率的測定，得到2個不同品種橙汁的最適澄清工藝參數(shù)。紅玉血橙的最佳工藝為果膠酶用量0.02 g/L，酶解溫度50℃，酶解時間97.59 min，透光率為96.8%；塔羅科血橙的最佳工藝為果膠酶用量0.05 g/L，酶解溫度37℃，酶解時間45 min，透光率為95.9%。