朱彬彬

（滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽滁州 239000）

石蒜（Lycoris radiata），又名龍爪、龍爪花、彼岸花、曼珠沙華，石蒜科石蒜屬多年生草本植物。石蒜花色美麗，花型奇特，被稱為“中國(guó)郁金香”，全世界約有石蒜屬植物20余種,我國(guó)15種，占全屬的75%[1]。國(guó)內(nèi)石蒜資源基本上處于野生狀態(tài)，主要分布在長(zhǎng)江以南，尤以江蘇、浙江及安徽3個(gè)省資源量最豐富，有13種，占國(guó)內(nèi)資源種類的86.4%[2]。

瑯琊山位于安徽省滁州市，其石蒜屬資源豐富，有近10個(gè)種，其中石蒜不僅分布面積大，而且與其他地區(qū)的石蒜相比，花色較濃，葉片更為粗大，故有學(xué)者認(rèn)為瑯琊山石蒜為多倍體石蒜。筆者以瑯琊山石蒜花粉為研究對(duì)象，采用TTC染色法、I-KI染色法、醋酸洋紅染色法和花粉萌發(fā)法測(cè)定其花粉生活力，以期為瑯琊山石蒜的植物學(xué)分類以及育種提供技術(shù)基礎(chǔ)[3]。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為安徽省滁州市瑯琊山上的石蒜。花粉采集在上午8～9時(shí)進(jìn)行，采集時(shí)選擇盛開的花朵，為了避免因植株個(gè)體和花藥引起的花粉活力差異，將花粉充分混勻[4]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TTC染色法。用膠頭滴管滴1～2滴0.5%TTC溶液于單面凹玻片凹槽內(nèi)，用鑷子取適量花粉輕輕彈放于溶液內(nèi)并使花粉均勻散開，然后蓋上蓋玻片。置于35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15～20min，取出用顯微鏡觀察，被染成紅色的花粉生活力較強(qiáng)，淺紅色次之，沒有被染色的為無活力花粉或不育花粉[5]。

1.2.2 I-KI染色法。取0.67gKI溶于5～10ml蒸餾水中，然后加入0.33g I2，再加蒸餾水定容至100mL，配制成I-KI溶液。用膠頭滴管滴加1～2滴I-KI溶液于單面凹玻片凹槽內(nèi)，用鑷子取適量新鮮花粉輕輕彈放于溶液內(nèi)并使花粉均勻散開，然后蓋上蓋玻片。置于35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15～20min，取出用顯微鏡觀察，被染成藍(lán)色的花粉為生活力較強(qiáng)的花粉，沒有被染色或顏色淡的均為無活力花粉或不育花粉。

1.2.3 醋酸洋紅染色法。用膠頭滴管滴加1～2滴醋酸洋紅溶液，用鑷子取適量新鮮花粉輕輕彈放于單面凹玻片凹槽內(nèi)使花粉均勻散開，然后蓋上蓋玻片。置于35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15～20min，取出用顯微鏡觀察，被染成紅色的花粉為生活力較強(qiáng)的花粉，沒有被染色或顏色較淡的均為無活力花粉或不育花粉[6]。

1.2.4 花粉萌發(fā)法。單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)：收集新鮮的石蒜花粉，充分混合均勻，進(jìn)行蔗糖、氯化鈣和硼酸的單因子試驗(yàn)，研究石蒜花粉離體萌發(fā)最適的蔗糖、氯化鈣和硼酸濃度。配制一系列濃度梯度的蔗糖、硼酸、氯化鈣溶液，所有溶液中瓊脂的含量都為4g/L，將配制好的溶液趁熱分裝到小培養(yǎng)皿，冷卻固化后制成固體培養(yǎng)基。蔗糖培養(yǎng)基的濃度梯度為 0g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，氯化鈣培養(yǎng)基的濃度梯度為0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，硼酸培養(yǎng)基的濃度梯度為0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L。把花粉均勻涂在固體培養(yǎng)基上，然后將培養(yǎng)皿放在25℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在顯微鏡下每隔2 h鏡檢1次，直至最后2次測(cè)定萌發(fā)率基本相同為止。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：通過單因子實(shí)驗(yàn)得出花粉萌發(fā)最適宜的蔗糖濃度，在蔗糖最適濃度條件下正交設(shè)計(jì)不同氯化鈣和硼酸濃度梯度組合，進(jìn)一步得出花粉萌發(fā)最適合的培養(yǎng)基組合濃度[7]。

以上所有試驗(yàn)中每個(gè)試驗(yàn)方法設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察5個(gè)視野，數(shù)出每個(gè)視野中花粉總數(shù)記錄下來，然后觀察被染色或萌發(fā)的花粉粒數(shù)，最后根據(jù)計(jì)算公式算出花粉活力。

花粉（活力）萌發(fā)率（%）=（已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/一個(gè)視野所觀察的所有花粉粒）×100。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 TTC染色法

試驗(yàn)中，供測(cè)試的3個(gè)制片中沒有觀察到被染成紅色的花粉，無法得出石蒜花粉活力的相關(guān)數(shù)據(jù)。因此，TTC染色法不適合瑯琊山的石蒜花粉生活力測(cè)定。

2.2 I-KI染色法

通過顯微鏡觀察3個(gè)制片石蒜花粉染色情況，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，可以得出（表1）I-KI染色的石蒜花粉生活力最高為100%，最低為73%，總平均值為93.66%。

表1 I-KI染色法測(cè)定石蒜花粉生活力

2.3 醋酸洋紅染色法

通過顯微鏡觀察3個(gè)制片石蒜花粉染色情況，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，可以得出（表2）石蒜花粉生活力最低為77.46%，最高的為98.89%，平均值為88.39%。

表2 醋酸洋紅染色法測(cè)定石蒜花粉生活力

2.4 花粉萌發(fā)法

通過單因子實(shí)驗(yàn)可以得知（表3）：花粉在蔗糖培養(yǎng)基濃度為150g/L時(shí)花粉萌發(fā)最高，萌發(fā)率為9.72%；在蔗糖培養(yǎng)基濃度為0g/L時(shí)花粉萌發(fā)最低，萌發(fā)率為3.06%。在氯化鈣培養(yǎng)基濃度為100mg/L時(shí)花粉萌發(fā)最高，萌發(fā)率為11.05%；在氯化鈣培養(yǎng)基濃度為0mg/L時(shí)花粉萌發(fā)最低，萌發(fā)率為2.01%。在硼酸培養(yǎng)基濃度為60mg/L時(shí)花粉萌發(fā)最高，萌發(fā)率為8.44%。在硼酸培養(yǎng)基濃度為80mg/L時(shí)花粉萌發(fā)最低萌發(fā)率為1.42%?？傊ǚ勖劝l(fā)最適培養(yǎng)液組合為蔗糖濃度150mg/L，氯化鈣濃度100mg/L，硼酸濃度60mg/L。

表3 不同因子對(duì)石蒜花粉萌發(fā)率的影響

表4 最適蔗糖濃度下硼酸、氯化鈣對(duì)石蒜花粉萌發(fā)率的影響

通過在蔗糖最適濃度（150g/L）條件下的正交試驗(yàn)可以得知（表4）：氯化鈣濃度100mg/L，硼酸濃度60mg/L的組合培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最高，為22.68%。這和單因子實(shí)驗(yàn)（表3）得出花粉萌發(fā)的最適濃度基本一致。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)在用于測(cè)定植物花粉生活力的方法有多種，每一種方法都有其使用的范圍，對(duì)于不同種類的花粉也應(yīng)選擇不同的方法。試驗(yàn)中TTC染色法無法測(cè)出石蒜的花粉生活力，TTC染色法受花粉自身特性，如花粉外壁的物質(zhì)構(gòu)成、花粉壁的薄厚、花粉內(nèi)各種酶活性的強(qiáng)弱等的影響較大，賈文慶等[8-10]在對(duì)紫薇、臺(tái)灣榿木、矮牽牛的花粉用TTC染色法測(cè)定生活力時(shí)發(fā)現(xiàn)該方法也無法使材料染色，因此，TTC染色法只適合某些植物花粉生活力的測(cè)定。

I-KI染色法的染色原理是正常的花粉中含有較多淀粉而染成藍(lán)色，發(fā)育不良的畸形花粉淀粉積累量很少，染色時(shí)呈黃褐色。I-KI染色法測(cè)定瑯琊山石蒜花粉生活力，結(jié)果偏高，只具有一定的參考價(jià)值。

醋酸洋紅染色法的染色原理是靠花粉中的脫氫輔酶而染色[11]。當(dāng)花粉失去活力時(shí)，該酶的活性仍然存在，依然被大量染色，所以該方法的測(cè)定結(jié)果偏高，所以筆者認(rèn)為醋酸洋紅染色法可以測(cè)定石蒜花粉生活力，但不適合準(zhǔn)確測(cè)定石蒜的花粉生活力。

花粉萌發(fā)法測(cè)定花粉生活力雖然操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，但得到的數(shù)據(jù)相對(duì)準(zhǔn)確可靠。筆者認(rèn)為雖然萌發(fā)法受試驗(yàn)材料、氣溫、濕度等影響，但只要操作準(zhǔn)確此法仍是測(cè)定花粉生活力首選方法。此次試驗(yàn)中花粉萌發(fā)率較低，有可能花粉是三倍體或是敗育的花粉。適宜濃度的蔗糖、硼酸、氯化鈣能夠促進(jìn)瑯琊山石蒜花粉的萌發(fā)，最適的培養(yǎng)基組合濃度是：蔗糖濃度150g/L+氯化鈣濃度100mg/L+硼酸濃度60mg/L。