仇志浪，郭凱斌，文 壯，鄧 彬，李正春，文曉鵬

(貴州大學 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學學院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】櫻桃(Cerasuspseudocerasus)屬薔薇科(Rosaceae)，李亞科(Prunoideae)，櫻屬(Cerasus)果樹，因其外觀鮮艷、味道鮮美，富含多種維生素，營養(yǎng)豐富，且成熟時間較早，有“早春第一果”的美譽[1]，深受人們喜愛，種植的經(jīng)濟效益顯著。根據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織(FAO)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球有記錄的櫻桃種植面積達401 656 hm2，比2010年增加4.2 %，世界各國櫻桃種植面積所占比例發(fā)生變化[2]。全球櫻桃種植面積廣，需求量大，尤其是中國大陸，需大量進口，供不應求。據(jù)統(tǒng)計，中國的櫻桃2016年產(chǎn)量激增約30 % (7.0萬t)，達32.0萬t。進口方面，2016 年中國大陸進口櫻桃總量稍有增加，達9.5萬t，香港進口8.0萬t，臺灣進口1.0萬t，總進口量達18.5 萬t，占世界櫻桃貿(mào)易的44.9 %[3]。因此，對櫻桃研究的進一步加深，使其產(chǎn)量提高，對減少進口、增加經(jīng)濟收入具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】花粉萌發(fā)率的高低會影響花粉授精，進而影響坐果，故櫻桃的產(chǎn)量與花粉萌發(fā)率密切相關(guān)。低溫和干燥的環(huán)境下，代謝過程減弱且呼吸作用降低，能較長時間保持花粉活力。隨貯藏時間的延長，花粉貯藏物質(zhì)消耗過多，酶活性下降，水分過度缺乏，從而使活力下降[4]。低溫保存可適當延長花粉壽命，但活力仍會下降，超低溫可長時間保持花粉活力[5]。目前已在扁桃[6]、獼猴桃[7]、澳洲堅果[8]、楊梅[9]、梨[10]、桃[11]等多種果樹中已經(jīng)成功實現(xiàn)超低溫保存花粉。但在櫻桃上研究較少，且只設(shè)置了3種溫度[液氮(-196 ℃)、-80 ℃及-20 ℃]進行保存，不具有代表性[12]?！颈狙芯壳腥朦c】櫻桃大多自交不親和[13]，花期易遭受不良氣候影響，導致落花落果現(xiàn)象嚴重，配制授粉樹、花期放蜂等方法可增加授粉機會；但因某些品種間花期不相遇，需對花粉進行保存來完成人工授粉。按照保存時間的長短，花粉保存方法可分為：短期保存(當年)和長期保存(次年)，但不同果樹花粉的保存方式存在一定差異，如扁桃與獼猴桃所需最好保存溫度就存在差異[6-7]。而櫻桃花粉保存方法比較的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，為找出較適保存方法，筆者等以貴州主栽櫻桃品種為試驗材料，比較各品種的花粉量，并以中國櫻桃“黑珍珠”為材料，從干燥時間、保存方法、預凍及解凍方式等方面篩選適合櫻桃花粉保存的最優(yōu)方法，旨在為櫻桃的人工授粉及雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以貴州主栽的中國櫻桃“黑珍珠”、“瑪瑙紅”和甜櫻桃“黑珍珠”、“斯帕克里”、“桑提娜”“布魯克斯”為材料，測定各櫻桃的花粉量和花藥量。

以中國櫻桃品種“黑珍珠”大花蕾期的花朵為材料，測定不同預凍和解凍方式、不同干燥時間、不同保存方法條件下的花粉萌發(fā)率。

以中國櫻桃品種“黑珍珠”小花蕾期(A)、大花蕾期(B)、全開放期(C)的花朵為材料，測定不同發(fā)育時期的萌發(fā)率。

小花蕾期材料：直徑4～6 mm，花朵緊實；大花蕾期材料：直徑7～9 mm，花朵膨脹充分，即將展開的；全開放期材料：直徑18～25 mm，花朵充分開放。

1.2 試驗方法

1.2.1 花藥量和花粉量的測定 花藥量的統(tǒng)計：隨機從同一植株挑選5個大花蕾期的花朵，以每個花蕾的花藥為單位，統(tǒng)計單花花藥量，3次重復，共3個植株，15個花蕾。

花粉量的統(tǒng)計采用纖維素酶法：分別取10粒完整的花藥放入1.5 mL離心管中，于25 ℃溫箱烘干，使其散粉，然后加入2 %的纖維素酶1 mL水解24 h，使粘連在花藥壁上的花粉粒游離下來。用渦旋振蕩器充分震蕩混勻后，取5 μl溶液于載玻片上，將載玻片置于顯微鏡下統(tǒng)計其花粉數(shù)量，3次重復。計算公式如下[14]：單花藥花粉量 (粒/花藥) = (每個載玻片上總花粉粒數(shù) × 200) /10。

1.2.2 花粉萌發(fā)率的測定 花粉萌發(fā)率的測定采用離體培養(yǎng)法，培養(yǎng)基配方為：MS培養(yǎng)基+10 %蔗糖+0.5 % 瓊脂糖+0.1g/L的硼酸[15]。方法：將培養(yǎng)基滴于凹槽載玻片上，待其凝固之后，用解剖針將花粉撒在培養(yǎng)基上[16]，放于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)并蓋上，置于25 ℃溫箱中培養(yǎng)6 h后在顯微鏡下統(tǒng)計花粉萌發(fā)率?；ǚ酃荛L度大于花粉粒直徑則記為萌發(fā)，否則記為未萌發(fā)。每處理 3 次重復，每個重復隨機選擇3個視野觀察，每個視野統(tǒng)計花粉數(shù)不少于100個。花粉萌發(fā)率的計算公式[17]：花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉管花粉數(shù)/觀測花粉總數(shù)×100 %。

1.2.3 預凍和解凍方式 將花粉分別在25 ℃下干燥0 h (A1)、2 h (A2)和4 h (A3)后，再分別做預凍處理，預凍處理方法[18]：B1，在4 ℃預凍2 h后，投入-80 ℃冰箱保存；B2，液氮速凍5 min后，投入-80 ℃冰箱保存；B3，直接投入-80 ℃冰箱保存。保存1周后將其取出，分別做解凍處理后再測定花粉萌發(fā)率，解凍方法：C1，在室溫解凍30 min；C2，自來水解凍15 min ；C3，37 ℃溫水解凍5 min 。

1.2.4 干燥和保存方法 將花粉取下，分別在25 ℃下干燥0、30、60和180 min后，將每一干燥溫度下的花粉平均分成5份，分別將其保存在室溫、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱和-196 ℃液氮條件下，在保存1、2、3、4、8及16周后測定花粉萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel對所有的花粉萌發(fā)率進行反正弦轉(zhuǎn)換。用SPSS 22.0軟件對花藥量和花粉量試驗數(shù)據(jù)進行均值和標準差計算，采用5(貯藏溫度)×4(干燥時間)×6(保存時間)及3(含水量)×3(預凍方式)×3(解凍方式)多變量數(shù)據(jù)模型進行方差分析，旨在探索出最佳預凍方式和解凍方式。對所得數(shù)據(jù)用Origin9.0作折線圖，用PhotoshopCS6軟件對花粉照片進行標記和圖像處理。

表1 貴州主栽櫻桃品種的單花花粉量

注：表中字母為最小顯著差異法0.05水平顯著性分析。

Note： Letters in the table indicate significant difference at 0.05 level.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同櫻桃品種的花粉量

從表1看出，不同品種單花花藥量存在較大差異，其中，中國櫻桃“黑珍珠”的花藥量最多，為47個/朵，顯著高于所有甜櫻桃(P<0.05)；其次為中國櫻桃品種“瑪瑙紅”(41個/朵)、甜櫻桃“斯帕克里”(39個/朵)、“黑珍珠”和“布魯克斯”(38個/朵)；“桑提娜”最少(33個/朵)。

不同櫻桃品種間花粉量存在較大差異(表1)，其中，甜櫻桃“桑提娜”花粉量最多，為3680粒/花藥；其次是甜櫻桃“黑珍珠”(3233粒/花藥)；中國櫻桃“黑珍珠”最少，為820粒/花藥。中國櫻桃的花粉量均極顯著低于甜櫻桃。甜櫻桃中“斯帕克里”的花粉量最少，與其他幾個品種間差異達極顯著水平(P<0.01)。

從每朵花來看，甜櫻桃“黑珍珠”的花粉量最多，為123 905粒/朵，其次是甜櫻桃“桑提娜”(121 629粒/朵)，中國櫻桃 “瑪瑙紅”最少(35 473粒/朵)；甜櫻桃各品種均高于中國櫻桃各品種。中國櫻桃兩品種間差異不顯著(P>0.05)；中國櫻桃的花粉量顯著低于甜櫻桃的花粉量(P<0.05)；在甜櫻桃品種中，“黑珍珠”花粉量最高，與另外幾個品種間差異達顯著水平(P<0.05)。

2.2 花粉萌發(fā)率

2.2.1 花蕾發(fā)育時期對花粉萌發(fā)率的影響 通過測定不同發(fā)育時期花蕾花粉量的結(jié)果表明，室溫保存1周后，大花蕾期花粉萌發(fā)率最高，為39.44 %，顯著高于小花蕾期花粉(26.20 %)，而全開放期花朵的花粉萌發(fā)率最低，僅25.93 %，但與小花蕾期的差異不顯著。為保證后續(xù)試驗的順利進行，所以選取大花蕾期的花粉進行后續(xù)花粉保存方法及花粉預凍、解凍方法篩選。

2.2.2 干燥時間對花粉萌發(fā)率的影響 中國櫻桃“黑珍珠”干燥處理前花粉萌發(fā)率為54.17 %，經(jīng)25 ℃干燥后花粉萌發(fā)率顯著降低，且隨干燥時間的增加花粉萌發(fā)率逐減(表2)。圖1所示，1周內(nèi)不同干燥時間下，隨保存溫度的變化，花粉萌發(fā)率影響較大，1周以后影響變小。25 ℃干燥30 min后保存效果最佳，直到第16周，干燥30 min后保存的花粉萌發(fā)率仍最高(11.40 %,表2)。但隨貯存時間的延長，干燥時間對花粉萌發(fā)率的影響逐漸降低。

2.2.3 保存方法對花粉萌發(fā)率的影響 如圖1所示，保存方法對花粉萌發(fā)率起著重要作用。無論干燥時間長短，花粉保存到第8周時，保存于室溫和4 ℃冰箱的花粉萌發(fā)率均降為0，但保存于-20、-80、-196 ℃條件下的花粉仍有萌發(fā)率。經(jīng)25 ℃干燥30 min的花粉在前2周都呈下降趨勢，在第3周時保存在-196和4 ℃的花粉萌發(fā)率有所上升，其中以4 ℃的花粉上升幅度較大。在第4周，-196和4 ℃保存條件下的花粉萌發(fā)率又開始下降，但在第4周時這2種保存條件下的花粉萌發(fā)率均高于其他3種保存條件下的花粉，而保存在室溫條件下的花粉經(jīng)過4周后，花粉萌發(fā)率降到最低。保存在-196 ℃的花粉直到第16周相對其他4種保存條件萌發(fā)率仍最高。

2.2.4 花粉含水量、預凍、解凍方式對花粉萌發(fā)率的影響 結(jié)果表明，解凍方式對花粉萌發(fā)率的影響較大，主體間效應在0.05水平差異顯著。未經(jīng)干燥的花粉(A1)直接投入-80 ℃冰箱(B3)并在室溫下解凍30 min(C1)后測定花粉萌發(fā)率效果最佳，萌發(fā)率為17.01 %。但在37 ℃溫水解凍的花粉萌發(fā)率均為0；在不受37 ℃溫水解凍的情況下，與干燥過的花粉相比，未經(jīng)干燥的花粉萌發(fā)率相對較高，但差異不顯著(P> 0.05)。

表2 干燥時間對不同保存溫度下花粉萌發(fā)率的影響

3 討 論

對自交不親和的果樹(如蘋果[19]、杏[20]、梨[21]、櫻桃[1]等)配制授粉樹、人工授粉、花期放蜂是提高坐果率的常用手段，因此，選擇優(yōu)良品種作為授粉樹尤為重要。在花粉活力相當?shù)那闆r下，花粉量越高，授粉成功率也越高。本研究所選貴州主栽的兩中國櫻桃品種中，“黑珍珠”的單花花粉量較“瑪瑙紅”多，但差異不顯著；4個甜櫻桃品種中，以甜櫻桃“黑珍珠”的單花花粉量最多，其次為“桑提娜”，“斯帕克里”最少；中國櫻桃品種的單花花粉量顯著低于甜櫻桃品種，推測該品種間差異可能是由于其自身遺傳特性和進化程度不一所導致[13]。

同一植物的花粉不同發(fā)育時期其花粉活力不一，這在唐菖蒲[22]、苜蓿[23]、非洲鳳仙花[24]植物中均已得到證實。此外，在大多有關(guān)花朵不同開放狀態(tài)或發(fā)育時期對花粉活力影響的報道中，大花蕾期或開放初期花粉均表現(xiàn)出較高的萌發(fā)率[25-27]。在貴州主栽櫻桃品種中，研究結(jié)果與前人一致。小花蕾期可能是由于其花粉未完全成熟而導致花粉萌發(fā)率低下，而全開放期則可能是由于暴露在外界環(huán)境中時間較長，受外界環(huán)境影響較大致使其萌發(fā)率降低。因此，如需進行人工授粉，大花蕾期花粉為最佳選擇。

花粉保存溫度、含水量是花粉保存時間長短的重要因素。含水量過高，可能導致花粉內(nèi)部水結(jié)冰致使細胞破壞，但含水量過低則可能是細胞失水，進而會引起細胞失活。在本研究中，從干燥時間對花粉萌發(fā)率的影響看，在1周內(nèi)未經(jīng)干燥的花粉萌發(fā)率普遍最高，保存于-196 ℃萌發(fā)率最低，這可能是由于溫度過低導致細胞內(nèi)部水分結(jié)晶而破壞細胞結(jié)構(gòu)所致；如保存時間在1周以內(nèi)，可選擇不經(jīng)干燥，待其散粉后保存于4 ℃下即可；如保存時間較長，可經(jīng)25 ℃干燥30 min后保存于-196 ℃環(huán)境，可延長保存時間。這與獼猴桃[7]、荔枝[28]、棗[29]等種質(zhì)花粉在4 ℃、-20 ℃、液氮保存研究結(jié)果相似。即花粉超低溫保存顯著延長了花粉保存壽命，但如因條件不能達到-196 ℃，則可選擇經(jīng)25 ℃干燥30 min后保存于-20 ℃中也可延長保存時間。綜合來看，如需長期保存，在25 ℃干燥30 min較為合適。而番茄[30]、魔芋[31]等材料的花粉則無需干燥，直接投入液氮保存即可達最佳效果，這可能與物種間遺傳特性有關(guān)。在辣椒花粉的保存上，適當降低花粉含水量可以保持較高的活力[32]。而本研究中，干燥時間較長的花粉其萌發(fā)率也有所降低，這可能是由于物種間花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不一所致，如細胞內(nèi)的結(jié)合水含量少，則會導致細胞過度失水而降低活力，因此應適當減少干燥時間。在花粉整個保存過程中，偶爾會出現(xiàn)后期花粉萌發(fā)率高于前一時期的花粉萌發(fā)率，這在其他的物種中也時常發(fā)生，但其原因目前尚不清楚[33]。

a，b，c，d分別代表在25 ℃條件下干燥0、30、60和180 min后保存不同時間的結(jié)果a，b，c and d represent the results of storing at different times after being dried at 25 ℃ for 0，30，60 and 180 minutes respectively圖1 25 ℃下干燥不同時間后保存方法和保存時間交互作用下的花粉萌發(fā)率Fig.1 Interactive effect of storage methods and storage time on pollen germination rates after drying at 25 ℃

除保存方法外，預凍和解凍的效果因植物種類和花粉含水量的不同而有較大差異[34]。在甘藍型油菜中，經(jīng)變溫預凍處理后液氮保存的花粉，逐步解凍法使花粉萌發(fā)率保持最高[35]。而在不同保存方式對扁桃花粉保存效果的影響研究中[6]，解凍方式以35 ℃解凍70s效果最好。本研究中，花粉在室溫下解凍30 min后的萌發(fā)率相對較高，而在37 ℃水浴解凍5min的花粉全部喪失活力，這可能是由于解凍溫度較高導致花粉出現(xiàn)破裂，進而導致花粉萌發(fā)率的喪失。比較分析顯示，直接放入-80 ℃進行保存的花粉萌發(fā)率較高，這與唐菖蒲[22]的研究結(jié)果類似。

4 結(jié) 論

綜上所述，如在1周內(nèi)需對櫻桃進行人工授粉，可選擇處于大花蕾期取粉，然后保存于4 ℃；如需大于1周的長期保存，則應將花粉經(jīng)25 ℃干燥30 min后，保存于-196 ℃，且在使用前應室溫解凍30 min后，方可達到最佳效果。