劉方舟，楊陽，張一穎，王琳，李萌，李園白

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700)

梔子GardeniajasminoidesEills是茜草科Rubiaceae梔子屬常綠灌木，又名山梔子、黃梔子、黃枝子等[1]。梔子為常用中藥，以干燥成熟果實(shí)入藥，廣泛分布于長江以南各省區(qū)，目前以江西、湖南兩省為主要種植區(qū)域[2]。梔子有效成分包括環(huán)烯醚萜苷類、藏紅花素類、三萜類及黃酮類、多糖、膽堿類化合物等[3]。

道地藥材是指來自特定產(chǎn)地、栽培規(guī)范、加工精細(xì)、貯藏合理、品質(zhì)卓越、療效顯著的中藥材，是傳統(tǒng)中醫(yī)藥行業(yè)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的一項(xiàng)獨(dú)特判別標(biāo)準(zhǔn)，其來源具有強(qiáng)烈的地域性[4]。藥材的道地性判斷、醫(yī)學(xué)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)源于中醫(yī)藥學(xué)，脫離中醫(yī)藥學(xué)理論基礎(chǔ)，道地藥材就如同無源之水，故中藥材的本草考證研究顯得尤為重要，可根據(jù)本草考證結(jié)果推斷藥材道地產(chǎn)區(qū)[5]。性狀特征作為道地藥材的傳統(tǒng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，可在一定程度上概括道地藥材外在特征[6]，但不能確切反映道地藥材的內(nèi)在品質(zhì)，因此，對(duì)道地藥材特征化學(xué)成分以及有效成分的含量測(cè)定，成為當(dāng)前道地藥材質(zhì)量特征評(píng)價(jià)的主要方法[7]，眾多研究結(jié)果表明，道地藥材與非道地藥材的指標(biāo)性成分含量有顯著性差異[8]。

1 方法與結(jié)果

1.1 梔子道地產(chǎn)區(qū)本草考證

考證古近代本草著作和主流醫(yī)學(xué)典籍，對(duì)梔子藥材歷代道地產(chǎn)區(qū)進(jìn)行歸納研究，本草考證所涉古代地名參照《古今地方大辭典》、《中華人民共和國行政區(qū)劃表》等映射得到現(xiàn)代地名，對(duì)現(xiàn)代地名進(jìn)行頻次統(tǒng)計(jì)，結(jié)合古籍原文相關(guān)描述推斷梔子道地產(chǎn)區(qū)。

梔子本草考證共涉獵秦朝、漢朝、南北朝、唐朝、宋朝、明朝相關(guān)古籍10本，包括：《神農(nóng)本草經(jīng)》、《名醫(yī)別錄》、《本草經(jīng)集注》、《千金翼方 藥出州土》、《新修本草》、《本草圖經(jīng)》、《本草品匯精要》、《本草原始》、《本草綱目》、《本草述》以及民國書籍《藥物出產(chǎn)辨》。摘錄出江陵府、臨江軍、清遠(yuǎn)、翁源、南陽、西蜀州郡等15個(gè)古代產(chǎn)區(qū)，對(duì)應(yīng)現(xiàn)代地名(省)7個(gè)，具體結(jié)果見表1?，F(xiàn)代產(chǎn)區(qū)頻次統(tǒng)計(jì)結(jié)果由高到低為河南省、四川省、江西省、湖北省和福建省，而近代民國時(shí)期多記載廣東省為梔子產(chǎn)區(qū)，具體結(jié)果見表2，結(jié)合古籍文獻(xiàn)相關(guān)文字描述推斷河南省南陽市、江西省樟樹市、湖北省江陵縣、福建省建甌市為梔子藥材的道地產(chǎn)區(qū)。

表1 梔子古近代產(chǎn)地本草考證結(jié)果對(duì)應(yīng)現(xiàn)代產(chǎn)地列表 mg·g-1

續(xù)表1

1.2 梔子性狀特征

針對(duì)梔子藥材性狀特征制定專業(yè)檢索策略，在CNKI數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)文獻(xiàn)，檢索式如下：

(SU=梔子+山梔+大山梔+黑梔子+黃梔子+支子+山枝+枝子+黃枝+炒梔子+焦梔子+梔子炭 AND TI=性狀+外觀+真?zhèn)?偽品+生藥+形狀+大小+氣味+味道+斷面特征+摻偽+摻假+真假+混淆品+混用品)OR((SU=金銀花 AND(SU=鑒定+鑒別 OR CLC=R282.5)AND SU=生藥+形狀+大小+氣味+味道+斷面特征))OR(SU=金銀花 AND KY=性狀+外觀+真?zhèn)?偽品+生藥+形狀+大小+氣味+味道+斷面特征+摻偽+摻假+真假+混淆品+混用品)NOT CLC=R284 NOT CLC=R285 NOT CLC=R285.5 NOT CLC=R285.6 NOT SU=基因 NOT SU=化學(xué) NOT SU=成分 NOT SU=分子 NOT SU=DNA NOT SU=RNA NOT SU=注射液 NOT SU=滴丸 NOT SU=片 NOT SU=膠囊 NOT SU=高效液相 NOT SU=HPLC NOT SU=飲片 NOT SU=丸

共檢索到梔子性狀特征相關(guān)文獻(xiàn)106篇，優(yōu)選有效文獻(xiàn)86篇，對(duì)文獻(xiàn)中藥材產(chǎn)地、全植物形狀、全植物大小、全植物色澤、全植物氣味、全植物味道、用藥部位、果實(shí)形狀、果實(shí)大小、果實(shí)色澤、果實(shí)表面特征、果實(shí)氣味、果實(shí)味道、果實(shí)斷面特征、果皮/果肉/果核/種子特征等字段進(jìn)行錄入加工，從中提煉歸納梔子道地藥材性狀特征如下：

①原植物：根呈圓錐形或圓柱形，略彎曲，有分枝，長短不等，直徑0.3～1.6 cm。表面灰黃色或棕黃色，有細(xì)長縱皺紋及圓點(diǎn)狀支根痕。外皮易脫落，呈不規(guī)則形。質(zhì)柔韌，不易折斷。斷面不平坦，黃白色，纖維性強(qiáng)，氣微香，味苦；莖呈圓柱形，較粗，外皮多不脫落，直徑0.6～2.2 cm，常二叉分枝，表面灰黑色，節(jié)間較明顯，有殘存葉柄痕或支根痕及膜質(zhì)托葉鞘。較易折斷，斷面不平坦，纖維性較強(qiáng)，黃綠色，氣清香，味苦；葉長橢圓形或長圓狀披針形，長5.6～8.5 cm，網(wǎng)狀脈，主脈明顯，全緣，革質(zhì)，表面黃棕色，托葉鞘狀，膜質(zhì)。氣稍淡，味微苦。②藥材：用藥部位為干燥果實(shí)，外觀呈橢圓形或長卵形，長1.4～2～3.5 cm，直徑1～1.5 cm，表面深紅色或紅黃色，有5～8條縱橫棱，頂端具殘留花萼，有非腺毛，多碎斷，另一端稍尖，有果柄痕，果皮薄而脆，內(nèi)表面呈紅黃色，有光澤，具2～3條突起的假隔膜，具密而細(xì)小的疣狀突起。氣微，味微酸而苦，折斷面鮮黃色，果皮薄而脆，有光澤，內(nèi)表面鮮黃色，有光澤，中間具2條假隔膜，種子多數(shù)，扁卵形，集成團(tuán)，棕黃色，表面有細(xì)密小點(diǎn)。

1.3 梔子化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)分析

針對(duì)梔子化學(xué)成分研究制定專業(yè)檢索策略，在CNKI數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)文獻(xiàn)，檢索式如下：

(TI=梔子+山梔+大山梔+黑梔子+黃梔子+支子+山枝+枝子+黃枝+炒梔子+焦梔子+梔子炭OR KY=梔子+山梔+大山梔+黑梔子+黃梔子+支子+山枝+枝子+黃枝+炒梔子+焦梔子+梔子炭)AND(SU=化學(xué)+成分+HPLC+UPLC+GC+MS+高效液相+質(zhì)譜+指紋圖譜+波譜解析+含量+提取物+揮發(fā)油+水提物+萃取+質(zhì)譜聯(lián)用+超臨界萃取+薄層+比色+NMR+液質(zhì)聯(lián)用+質(zhì)量評(píng)價(jià)+質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) OR CLC=R284+R284.1+R284.2+R284.3)NOT CLC=R285 NOT CLC=R285.5 NOT CLC=R285.6 NOT SU=基因 NOT SU=分子 NOT SU=DNA NOT SU=RNA NOT SU=注射液 NOT SU=滴丸 NOT SU=片 NOT SU=膠囊 NOT SU=飲片 NOT SU=丸 NOT SU=口服液 NOT SU=軟膏

共檢索到梔子化學(xué)成分相關(guān)文獻(xiàn)1461篇，從中優(yōu)選出101篇含量測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)、成分全面、數(shù)據(jù)相對(duì)規(guī)范的有效文獻(xiàn)，整合文獻(xiàn)中梔子成分含量數(shù)據(jù)，共提煉出安徽、福建、廣西、湖北、河南、湖南、江蘇、江西、四川、浙江10個(gè)不同產(chǎn)地梔子的10個(gè)化學(xué)成分含量結(jié)果，涉及成分包括雞矢藤次苷甲酯(scandoside methyl ester)、京尼平苷酸(geriposidic acid)、京尼平龍膽二糖苷(genipin-1-β-D-gentiobioside)、去乙酰車葉草甘酸甲酯(methyl deacetyl asperulosidate)、山梔苷(shanzhiside)、梔子新苷/梔子酮苷(gardoside)、梔子苷/京尼平苷(geniposide)、羥異/羥基梔子苷(gardenoside)、西紅花苷-1(crocin-1)、西紅花苷-2(crocin-2)，10個(gè)不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材的10種成分含量平均值見表3。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面清洗及規(guī)范化處理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、主成分分析和聚類分析，對(duì)梔子化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。

表3 不同產(chǎn)地梔子化學(xué)成分平均值 mg·g-1

1.3.1 數(shù)據(jù)清洗與標(biāo)準(zhǔn)化處理 不同來源數(shù)據(jù)規(guī)范單位為mg·g-1，將產(chǎn)地統(tǒng)一規(guī)范到“省”級(jí)行政單位，用SPSS處理極端值與錯(cuò)誤值，用Analyze-DescriptiveStatistics-Descriptives-Savestandardizedvalvesasvariables方法對(duì)不同量綱數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，標(biāo)準(zhǔn)化描述性分析結(jié)果見表4。

文獻(xiàn)中梔子苷的中英文對(duì)照存在混淆，梔子苷、京尼平苷、羥基梔子苷、羥異梔子苷等名稱存在普遍混用情況，梔子酮苷和梔子新苷對(duì)應(yīng)同一英文名稱gardoside，甚至同一物質(zhì)在一篇文章中出現(xiàn)兩個(gè)完全不同的名稱。針對(duì)這種情況，本研究通過分析文章中化合物英文名稱，到Molbase查詢得到化合物CAS號(hào)，相同CAS號(hào)代表同一物質(zhì)，據(jù)此對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化整合。梔子中各化合物中英文名稱及CAS號(hào)對(duì)照情況見表5。

表4 SPSS數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理描述性統(tǒng)計(jì)資料

表5 梔子中各化合物中英文名稱及CAS號(hào)對(duì)照表

1.3.2 單因素方差分析 本研究對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材的10種化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行多指標(biāo)兩兩比較，經(jīng)清洗及規(guī)范化處理后數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。分析結(jié)果見表6。

結(jié)果顯示，對(duì)于雞矢藤次苷甲酯、京尼平苷酸、京尼平龍膽二糖苷3個(gè)指標(biāo)，河南、四川、江西產(chǎn)區(qū)梔子樣品指標(biāo)值大都顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，指標(biāo)正值結(jié)果與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)；對(duì)于去乙酰車葉草甘酸甲酯，各產(chǎn)區(qū)指標(biāo)值間無顯著性差異(P>0.05)，觀察指標(biāo)數(shù)值趨勢(shì)，湖北、河南、福建及江西產(chǎn)區(qū)指標(biāo)值較高，與其他產(chǎn)區(qū)樣品有一定差異；對(duì)于山梔苷、梔子新苷/梔子酮苷、羥異/羥基梔子苷3個(gè)指標(biāo)，江西、安徽、四川產(chǎn)區(qū)樣品指標(biāo)值大都顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，指標(biāo)正值結(jié)果與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)；對(duì)于梔子苷/京尼平苷，江西、河南、湖北產(chǎn)區(qū)梔子樣品指標(biāo)值大都顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，指標(biāo)正值結(jié)果與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)；對(duì)于西紅花苷-1、西紅花苷-2這兩個(gè)指標(biāo)，則主要是浙江、江西產(chǎn)區(qū)指標(biāo)正值與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)。

綜上，江西產(chǎn)區(qū)梔子樣品差異最大，除去乙酰車葉草甘酸甲酯成分外，其余各指標(biāo)值均明顯高于其它產(chǎn)區(qū)，具顯著性差異(P<0.05)；河南、四川產(chǎn)區(qū)樣品差異也較大，多項(xiàng)指標(biāo)與其它產(chǎn)區(qū)比較具顯著性差異；另外，浙江產(chǎn)區(qū)對(duì)于指標(biāo)西紅花苷-1、西紅花苷-2與其它產(chǎn)區(qū)比較，有顯著性差異，此2成分屬藏紅花素類化合物，據(jù)此推斷，浙江產(chǎn)區(qū)梔子藥材可能含有較高含量的藏紅花素類化合物。

表6 不同產(chǎn)地梔子多指標(biāo)兩兩比較

續(xù)表6

續(xù)表6

注：*P<0.05。

圖1 各產(chǎn)區(qū)京尼平苷酸平均值

圖2 各產(chǎn)區(qū)梔子苷/京尼平苷平均值

1.3.3 主成分分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)梔子藥材中雞矢藤次苷甲酯、京尼平苷酸、京尼平龍膽二糖苷、去乙酰車葉草甘酸甲酯、山梔苷、梔子新苷/梔子酮苷、梔子苷/京尼平苷、羥異/羥基梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2這10個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析[9]，以特征根>1，為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到4個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率64.181%，詳見表7及表8。

圖4 各產(chǎn)區(qū)西紅花苷-1平均值

表7 主成分初始特征值及貢獻(xiàn)率

表8 主成分荷載矩陣

圖5 主成分荷載圖

根據(jù)主成分荷載值，得到各主成分線性模型組合表達(dá)式：

F1=-0.172×1-0.034×2+0.019×3-0.036×4+0.387×5+0.396×6+0.164×7+0.181×8+0.201×9+0.199×10

(1)

F2=0.408×1+0.59×2+0.005×3+0.017×4+0.078×5-0.067×6-0.028×7-0.053×8-0.048×9+0.355×10

(2)

F3=0.378×1-0.026×2+0.511×3-0.055×4-0.211×5-0.021×6+0.105×7+0.316×8+0.073×9-0.389×10

(3)

F4=0.029×1+0.049×2+0.026×3+0.744×4+0.105×5-0.083×6+0.42×7-0.326×8+0.003×9-0.159×10

(4)

利用4個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率線性加權(quán)求和得到梔子藥材各產(chǎn)區(qū)質(zhì)量的綜合得分評(píng)價(jià)函數(shù)：

F=(22.63×F1+15.383×F2+14.735×F3+11.433×F4)/64.181

(5)

綜合評(píng)價(jià)指數(shù)F數(shù)值越高，表示藥材質(zhì)量越好。江西產(chǎn)區(qū)梔子整體評(píng)分最高，質(zhì)量最好，河南和四川產(chǎn)區(qū)梔子評(píng)分較好，水平尚佳，其余產(chǎn)區(qū)梔子評(píng)分較低，水平一般。

1.3.4 聚類分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)梔子藥材中雞矢藤次苷甲酯、京尼平苷酸、京尼平龍膽二糖苷、去乙酰車葉草甘酸甲酯、山梔苷、梔子新苷/梔子酮苷、梔子苷/京尼平苷、羥異/羥基梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2這10個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的平均值進(jìn)行聚類分析。選擇Ward’s method作為聚類方法，樣品間距離的計(jì)算采用歐式距離平方(Squareded Euclidean distance)法，聚類結(jié)果見圖6。

圖6 各產(chǎn)區(qū)指標(biāo)平均值聚類分析圖

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)閾值介于5～10時(shí)，10個(gè)產(chǎn)區(qū)梔子樣品可劃分為3大類，說明不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材質(zhì)量存在差異。第一大類包括江西、河南、湖北、福建4個(gè)產(chǎn)區(qū)，綜合參考表3中各產(chǎn)區(qū)指標(biāo)含量的平均值來看，該大類各指標(biāo)值均較高；第二大類包括湖南、浙江、廣西、西川、安徽，各指標(biāo)值大都處于中等水平；第三大類為江蘇，該產(chǎn)區(qū)各指標(biāo)值普遍較低。

2 討論

道地性是評(píng)價(jià)中藥品質(zhì)優(yōu)劣的傳統(tǒng)理論和方法，是中醫(yī)藥學(xué)經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)總結(jié)，也是中醫(yī)理論在長久實(shí)踐過程中提煉出來的對(duì)中藥質(zhì)量控制的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]。道地藥材存在其化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)特性[11]，具體表現(xiàn)為活性成分的含量差異。采用系統(tǒng)、科學(xué)的理論體系和方法來揭示藥材道地性的科學(xué)內(nèi)涵、探索道地性物質(zhì)基礎(chǔ)的形成機(jī)理是道地藥材研究的關(guān)鍵[12]。

中藥材化學(xué)組成復(fù)雜、成分眾多，藥效的發(fā)揮往往不取決于單一成分，而是多成分間協(xié)作的結(jié)果[13]，因此，在研究中需要收集大量數(shù)據(jù)與信息[14]。針對(duì)某藥材品種僅采納單一文獻(xiàn)研究得到的一種或幾種成分含量測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行分析的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法具有較大的局限性，缺乏系統(tǒng)性與全面性。理論上綜合分析的成分越多，越接近藥材化學(xué)成分的整體組成，評(píng)價(jià)結(jié)果就越全面、準(zhǔn)確。為了將隱沒在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中重要信息集中提煉出來，避免對(duì)梔子藥材道地性質(zhì)量研究的片面性，本研究整合以往研究成果，從1461篇梔子化學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)中優(yōu)選出101篇含量測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)、成分全面、數(shù)據(jù)相對(duì)規(guī)范的有效文獻(xiàn)，整合有效文獻(xiàn)中梔子成分含量數(shù)據(jù)[15]，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面清洗及規(guī)范化處理，采用單因素方差分析、主成分分析和聚類分析方法對(duì)梔子化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，綜合評(píng)價(jià)結(jié)果顯示江西為梔子最優(yōu)產(chǎn)區(qū)，河南、湖北、福建、四川次之，其余產(chǎn)區(qū)梔子質(zhì)量不佳。該結(jié)果與本草考證所得梔子道地產(chǎn)區(qū)頗為一致，為梔子藥材道地性評(píng)價(jià)提供有利支撐。

關(guān)于異源數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理與整合問題，筆者整理數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中梔子苷的中英文對(duì)照存在混淆，梔子苷、京尼平苷、羥基梔子苷、羥異梔子苷等名稱存在普遍混用情況，這種對(duì)結(jié)構(gòu)相似化合物、或不同英文名稱卻譯為相同中文名稱的狀況，使得梔子苷等化合物在現(xiàn)代中藥學(xué)研究[16]、分析檢測(cè)方法、成分含量分析等方面出現(xiàn)混淆，對(duì)研究者造成相當(dāng)程度上的誤導(dǎo)，尤其針對(duì)研究較廣泛的中藥成分，此種混亂將給研究者帶來更大的困擾[17]。針對(duì)這種情況，本研究通過分析文章中化合物對(duì)應(yīng)的英文名稱，并到Molbase查詢得到化合物CAS號(hào)，一種成分具有唯一的CAS號(hào)，據(jù)此原則整理得到梔子中各化合物中英文名稱及CAS號(hào)對(duì)照表，根據(jù)對(duì)照表對(duì)各產(chǎn)區(qū)梔子成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化整合，確保了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性與科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性。