趙一全， 馬茹霞， 李家威， 晏 磊， 羅 濤， 梅自力， 王偉東

(1.黑龍江八一農(nóng)墾 大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室， 黑龍江 大慶 163319； 2.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所， 農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室， 成都 610041)

我國作為農(nóng)業(yè)大國秸稈資源量豐富，但利用率較低造成了資源浪費和環(huán)境污染，利用秸稈生產(chǎn)沼氣是提高秸稈利用率和緩解環(huán)境污染的有效途徑之一。沼氣發(fā)酵是在多種微生物共同作用下完成的，溫度[1]，濃度[2]，接種物，C/N[3-4]，pH值[5]和攪拌[6]以及物料成分配比[7-8]等對厭氧發(fā)酵有重要影響。氮素是影響沼氣發(fā)酵重要的營養(yǎng)元素之一，秸稈的碳氮比極高，這意味著以秸稈為原料的沼氣發(fā)酵體系中氮素對于發(fā)酵過程的影響可能更大，優(yōu)化發(fā)酵條件有利于微生物迅速繁殖，從而提高反應(yīng)器性能和沼氣產(chǎn)量。

根據(jù)秸稈的分子式計算秸稈完全液化能夠提供厭氧發(fā)酵微生物所需的氮[9]，但秸稈在實際發(fā)酵過程中很難全部被利用，且分解時間較長，微生物所需的氮含量不能在發(fā)酵各個階段滿足微生物的需求，尤其是在發(fā)酵初始階段，影響了沼氣工程的發(fā)酵效率和最終產(chǎn)量。余少杰等通過添加不同濃度的氯化銨來研究外加氮源對秸稈厭氧發(fā)酵的影響，研究結(jié)果[10]顯示適量濃度的氮添加可以促進(jìn)厭氧發(fā)酵體系中纖維素等物料的水解，而高濃度的氮素添加會抑制纖維素水解和甲烷生成。Piactek[11]等通過模型分析發(fā)現(xiàn)氮含量是影響水解和甲烷生成過程動力學(xué)的關(guān)鍵因素。Wagner[12]等研究了添加不同種類的氮源在厭氧發(fā)酵過程中對甲烷產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)氮源中碳含量會影響甲烷的產(chǎn)率，在適宜的濃度范圍內(nèi)才能獲得較高的甲烷產(chǎn)量。雖然原料中碳素轉(zhuǎn)化為CH4和CO2是碳素間的循環(huán)，但在厭氧發(fā)酵中，微生物是將秸稈中的碳素轉(zhuǎn)化為CH4的功能執(zhí)行者。Wagner[13]等從多樣性指數(shù)上分析了不同氮源對微生物多樣性的影響，但未對功能菌株的豐度變化進(jìn)行闡述。Alsouleman[14-15]等研究發(fā)現(xiàn)，高氨氮脅迫下厭氧反應(yīng)體系發(fā)生適應(yīng)性變化，主導(dǎo)菌群從擬桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)樗缶?。隨著宏基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用宏基因組技術(shù)來研究樣本中直接參與碳和氮循環(huán)的功能微生物類群的總量和多樣性是近年來環(huán)境微生物的研究熱點之一，但對添加氮素后微生物群落多樣性以及功能基因的變化以及如何影響發(fā)酵體系和甲烷產(chǎn)量的研究鮮有報道。因此，研究氮素添加對沼氣發(fā)酵過程中微生物群落和關(guān)鍵功能基因的影響具有重要意義。

本研究解析玉米秸稈沼氣發(fā)酵過程中添加氮素對料液中微生物多樣性的影響，探究產(chǎn)甲烷關(guān)鍵功能基因豐度的變化，通過計算纖維素等物料的降解情況并結(jié)合產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣周期，從微生物和功能基因的角度揭示氮素添加與秸稈沼氣產(chǎn)量之間的關(guān)系，解析發(fā)酵過程中不同階段細(xì)菌、古菌的多樣性與功能特征，注釋功能菌株的豐度的變化，進(jìn)一步探究沼氣發(fā)酵中關(guān)鍵因子的作用，為提高玉米秸稈沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣效率提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

試驗用玉米秸稈取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)實驗實習(xí)基地，在10月份收獲籽粒后，秸稈風(fēng)干粉碎備用，接種污泥源于本實驗室運行良好的厭氧發(fā)酵反應(yīng)器，主要性質(zhì)見表1，其中玉米風(fēng)干秸稈的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為30.52%，27.77%和10.99%。

表1 發(fā)酵原料的主要性質(zhì)

1.2 間歇式秸稈沼氣發(fā)酵體系建立

試驗裝置選用25 L自制厭氧發(fā)酵反應(yīng)器，上設(shè)有出氣口和進(jìn)料口，下設(shè)有出料口。出氣口與15 L集氣袋相連，用于收集氣體并測定體積(見圖1)。甲烷含量通過GA2000便攜式沼氣分析儀(Geotech Biogas Check)測定。發(fā)酵體積為20 L，接種污泥12 L，總TS設(shè)定為8%，啟動時秸稈一次性進(jìn)料，不足蒸餾水補(bǔ)齊。

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，選取添加有機(jī)氮尿素1 g·L-1作為處理，不加氮為對照，設(shè)置3個重復(fù)，控制發(fā)酵溫度為35℃，反應(yīng)時間60 d。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，每10 d進(jìn)行1次投料，物料添加量為總秸稈添加的1/6。

圖1 發(fā)酵裝置

1.3 試驗方法

1.3.1 16SrRNA測序

在前期連續(xù)進(jìn)料的沼氣發(fā)酵試驗中，對照和處理分別在發(fā)酵的第1，10，40天和60天進(jìn)行取樣，每個樣品平行取3次，混合均勻后加入緩沖液(Extraction Buffer)-20℃保藏。利用改進(jìn)的氯化芐法提取樣品總DNA[16]。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Nanodrop 2000c(Thermo)檢測DNA的純度和濃度。將合格的樣品總DNA送至四川博貝特生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)區(qū)域：細(xì)菌16S V4區(qū)引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和909R(5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)。古菌引物344F(5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

1.3.2 統(tǒng)計分析

研究采用originpro 2017軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

1.3.3 宏基因組學(xué)分析

在第一次產(chǎn)氣高峰第10天進(jìn)行取樣，處理與對照樣品平行取3次，混合均勻后加入緩沖液(Extraction Buffer)，將樣品送至上海派森諾公司進(jìn)行DNA提取和宏基因組測序。

1.3.3.1 物種注釋

將每個樣本的Scaffolds/Scaftigs序列與NCBI-NT數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌、古菌、真菌和病毒序列進(jìn)行BLASTN相似性比對(E值設(shè)定為< 0.001)。由于每一條目標(biāo)序列可能匹配多條參考序列，而這些匹配的參考序列又分屬不同的分類單元，為使分析嚴(yán)謹(jǐn)可靠，同時又不丟失生物學(xué)意義，我們在MEGAN軟件中采取“最低共同祖先(Lowest Common Ancestor，LCA)”算法[17]，將參考序列分化為不同物種分枝前的最后一級共同分類，作為目標(biāo)序列的物種分類注釋信息。結(jié)合Scaffolds/Scaftigs序列在各樣本中的豐度數(shù)據(jù)，獲得各樣本在所需分類等級上的相對豐度分布表。

1.3.3.2 功能注釋

基因的功能注釋是將非冗余蛋白序列集同常用的蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而對各樣本中的基因功能進(jìn)行注釋分析。KEGG注釋是指通過將蛋白序列和KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對宏基因組預(yù)測得到的基因根據(jù)代謝通路進(jìn)行注釋和分類。我們將上述非冗余蛋白序列集上傳至KAAS(KEGG Auto maticAnnotation Server)進(jìn)行功能注釋，并對返回的注釋結(jié)果進(jìn)行匯總統(tǒng)計，獲取各等級的注釋結(jié)果及對應(yīng)的豐度信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加氮素對間歇式秸稈沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

在發(fā)酵的前28 d，處理的日產(chǎn)氣量穩(wěn)定且高于對照(見圖2)，在第10天達(dá)到第1個產(chǎn)氣高峰，為17750 mL·d-1。處理和對照均在第25天達(dá)到產(chǎn)氣高峰，分別為15077 mL·d-1和11707 mL·d-1。從第28天到第41天，對照恢復(fù)其產(chǎn)氣潛力，日產(chǎn)氣量高于處理，發(fā)揮產(chǎn)氣優(yōu)勢。發(fā)酵前30 d進(jìn)料對產(chǎn)氣量的變化并不明顯，從第40天開始，處理和對照在產(chǎn)氣量上無顯著性差異，產(chǎn)氣趨勢相似。產(chǎn)氣量在每次進(jìn)料后均上升，之后開始下降，到下一次進(jìn)料產(chǎn)氣量又出現(xiàn)了顯著提升。測定發(fā)酵結(jié)束后纖維素和半纖維素降解率，處理達(dá)到33%和44%，顯著高于對照的6%和28%。

圖2 加氮處理和對照的日產(chǎn)氣量

日產(chǎn)甲烷量變化趨勢與日產(chǎn)氣量的變化趨勢相似，筆者對發(fā)酵進(jìn)行不同天數(shù)后的累積甲烷產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計分析(見圖3)，發(fā)酵前10 d，20 d，30 d處理的甲烷累積產(chǎn)量分別是64943 mL，137048 mL，199459 mL，顯著高于對照的14110 mL，50343 mL，123720 mL。發(fā)酵前40 d，處理的甲烷累積產(chǎn)量仍高于對照。發(fā)酵結(jié)束后，處理的甲烷總產(chǎn)量為308200 mL，仍然高于對照的284728 mL。處理在第10天達(dá)到第1個產(chǎn)甲烷高峰，為10880 mL·d-1。對照在第20天達(dá)到一個峰值，為6103 mL·d-1。處理和對照均在第23天達(dá)到日產(chǎn)甲烷產(chǎn)量的最高峰，分別為11388 mL·d-1和8164 mL·d-1。從第26天到第41天，對照日產(chǎn)甲烷量高于處理。從第41天到發(fā)酵結(jié)束，處理和對照的甲烷產(chǎn)量無顯著差異。

圖3 發(fā)酵不同時期甲烷累積產(chǎn)量

2.2 玉米秸稈沼氣發(fā)酵過程中細(xì)菌和古菌組成多樣性分析

2.2.1 16SrRNA測序結(jié)果

發(fā)酵料液中提取的7個樣品總DNA條帶清晰，雜質(zhì)較少，無嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象。Nanodrop檢測出的DNA濃度在197.8～380.9 ng·L-1之間，OD260/280在1.90～2.07之間，均符合送樣要求(濃度>10 ng·L-1；OD260/280在1.8～2.2之間)。對7個樣品中的細(xì)菌和古菌的16SrRNA V4區(qū)序列進(jìn)行高通量測序。對比Shannon指數(shù)可以看出(見表2)，古菌的Shannon指數(shù)均低于細(xì)菌，說明細(xì)菌的微生物多樣性要高于古菌的多樣性。比較處理和對照中的細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)，發(fā)酵第10天處理高于對照，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，對照Shannon指數(shù)增加，說明其多樣性有所增加，而處理的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均呈下降趨勢，微生物多樣性下降。從古菌的Alpha多樣性指數(shù)變化規(guī)律可以看出，處理中古菌多樣性的變化規(guī)律同處理中細(xì)菌變化一致。

表2 細(xì)菌/古菌Alpha多樣性指數(shù)

注:常見的Alpha多樣性指數(shù)有Chao1豐富度指數(shù)，Shannon多樣性指數(shù)，Simpson指數(shù)等。

2.2.2 發(fā)酵料液中細(xì)菌和古菌群落組成分析

將細(xì)菌的各菌群豐度占比1%以上的25類菌屬作圖(見圖4)，從屬的分類水平進(jìn)行分析，發(fā)酵原料中Clostridium占比最高。對照中，普氏菌屬(Prevotella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和Sphaerochaeta占比較高。處理中Ruminofilibacter，密螺旋體屬(Treponema)和Sphaerochaeta占比較高。比較發(fā)酵各時期對照和處理均表現(xiàn)出不同的細(xì)菌菌群組成，二者優(yōu)勢菌群各不相同，菌群多樣性存在差異。比較對照和處理發(fā)現(xiàn)，Sphaerochaeta菌屬在發(fā)酵的各時期均存在。

古菌的各菌群豐度在屬的分類水平上分析(見圖5)，在整個發(fā)酵過程中，甲烷鬃毛菌屬(Methanosaeta)(36.7%～68.7%)一直占據(jù)最高比例。對照中占比較高的菌群包括Methanosaeta(45.8%～57.1%)，Methanoculleus(5.6%～16.2%)。處理中占比較高的菌群包括Methanosaeta(36.7%～68.7%),Methanoculleus(7.2%～14.2%)和甲烷螺旋菌屬(Methanospirillum)(6.6%～8.5%)。

圖4 發(fā)酵料液中細(xì)菌群落組成

在發(fā)酵第10天時，對照中Methanosaeta的豐度為57.1%，處理為36.7%，優(yōu)勢菌群Methanosaeta的數(shù)量隨氮濃度的增加而減少。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，處理中的Methanosaeta豐度逐漸增加，但對照中卻在中期開始減少。說明Methanosaeta在氮素充足的環(huán)境中缺少競爭力，豐度下降。只有在環(huán)境中營養(yǎng)成分缺少的情況下Methanosaeta的競爭力才開始顯現(xiàn)，成為環(huán)境中的優(yōu)勢菌屬。Methanoculleus的豐度也受氮素的影響，其豐度隨著氮濃度的升高而增加，Methanoculleus能在氮素充足的環(huán)境中快速成為優(yōu)勢菌屬，隨著發(fā)酵的持續(xù)和氮素的消耗，對照中Methanoculleus的豐度要高于處理。說明Methanoculleus可以充分利用秸稈分解后的營養(yǎng)物質(zhì)成為環(huán)境中優(yōu)勢菌屬，在環(huán)境中有較強(qiáng)的競爭力和適應(yīng)能力。在發(fā)酵初期，氮素處理產(chǎn)氣顯著高于對照，可以看出在玉米秸稈厭氧發(fā)酵過程中，Methanoculleus對產(chǎn)氣的貢獻(xiàn)更大。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，對照產(chǎn)氣量持續(xù)提升，較處理產(chǎn)氣率高，其中的甲烷桿菌屬(Methanobacterium)豐度逐漸提升，對產(chǎn)氣提升做出了較大貢獻(xiàn)。

圖5 發(fā)酵料液中古菌群落組成(屬)

2.3 玉米秸稈沼氣發(fā)酵體系宏基因組學(xué)研究

2.3.1 物種豐度差異分析

前期16SrRNA gene測序分析已經(jīng)證明在發(fā)酵10 d處理和對照在豐度上存在差異，利用宏基因組數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步分析每個樣本在各分類學(xué)水平的組成豐度分布，逐一比較每個分類單元在兩個樣本之間的豐度差異，并通過統(tǒng)計檢驗評價差異是否顯著。處理與對照在門水平上有27個門具有顯著差異，屬水平上有475個屬具有顯著差異，在種水平上有777個種具有顯著差異(見表3)。物種豐度的變化直接影響沼氣發(fā)酵體系群落的功能性，尤其是功能菌種豐度的顯著變化，通過以上數(shù)據(jù)可知，氮素添加能夠顯著影響發(fā)酵體系中微生物的豐度。

表3 豐度差異分析統(tǒng)計

注:表中第一列為兩兩比較的樣本名；第二列至第四列分別對應(yīng)兩兩比較中被認(rèn)為具有顯著差異的門、屬和種的數(shù)量

2.3.2 功能基因差異分析

在功能基因水平上，我們分析了能量代謝中各功能基因的豐度(見圖6)，發(fā)現(xiàn)氮素處理中甲烷代謝(methane metabolism)的豐度高于處理，而氧化磷酸化等有關(guān)能量代謝的基因的豐度變化不明顯。甲烷代謝基因是產(chǎn)甲烷的關(guān)鍵基因，氮素添加提升了甲烷代謝基因的豐度。

圖6 能量代謝中各功能基因的豐度柱狀圖

3 討論

Wagner[11]等研究了多種氮源添加對產(chǎn)氣高峰期的影響，與本研究的氮素添加后產(chǎn)氣高峰提前且一段時間產(chǎn)氣量顯著提升的研究結(jié)果一致，但沒有對多周期發(fā)酵進(jìn)行測定。我們在研究氮素添加的半連續(xù)發(fā)酵結(jié)果顯示，處理在中后期產(chǎn)氣能力低于對照。氮素添加雖然促進(jìn)了纖維素的水解，為古菌的代謝提供了營養(yǎng)底物。但隨發(fā)酵進(jìn)行，處理中其它微生物所需的元素和營養(yǎng)底物被大量消耗，后期雖然氮素含量和對照持平，但根據(jù)元素守恒定律，其它必需元素含量會低于對照。而對照初期由于氮素含量和其他營養(yǎng)物質(zhì)含量低，細(xì)菌代謝和纖維素水解受到限制，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，纖維素水解產(chǎn)物等營養(yǎng)物質(zhì)含量增加，細(xì)菌和古菌多樣性逐漸提高，產(chǎn)氣潛力開始顯現(xiàn)。但整個發(fā)酵過程中處理的纖維素等物料的水解率顯著高于対照，提供了更多的營養(yǎng)物質(zhì)，處理的總甲烷產(chǎn)量仍高于対照。

在發(fā)酵起始階段Clostridium豐度占比較高，這與Weimer[18]等發(fā)現(xiàn)Clostridium能夠?qū)⒗w維素和半纖維素等大分子水解成葡萄糖的結(jié)果一致。甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)等產(chǎn)甲烷古菌的豐度提升可能和產(chǎn)酸菌群一樣受氮素含量和底物濃度影響。產(chǎn)氣高峰期Methanosarcina豐度增加，對產(chǎn)甲烷具有較大貢獻(xiàn)，這與Bharathi[19]等的研究結(jié)論一致。Methanosaeta在處理和對照中豐度一直占據(jù)優(yōu)勢，Carr[20]等發(fā)現(xiàn)Methanosaeta有較強(qiáng)的產(chǎn)甲烷能力，結(jié)論與本研究結(jié)果相似。發(fā)酵體系中還注釋到Sphaerochaeta，Abt B[21]等曾在白蟻的腸道中分離出該均屬。Ritalaht[22]等曾在紅杉河底層沉積物中分離出Sphaerochaeta.globosa，發(fā)現(xiàn)其能利用多種底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)甲酸鹽和乙酸鹽。但在沼氣發(fā)酵體系中，鮮有關(guān)于Sphaerochaeta的報道，其在玉米秸稈降解產(chǎn)甲烷環(huán)境中可能具有重要作用。

張彩杰[23]等在研究了C/N對細(xì)菌群落的影響時發(fā)現(xiàn)，碳氮比降低，細(xì)菌多樣性提升，優(yōu)勢菌群豐度增高，這與本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的變化規(guī)律相同。本研究還分析了在產(chǎn)甲烷階段具有重要作用的古菌群落多樣性，發(fā)現(xiàn)古菌的群落多樣性變化和細(xì)菌相似。對于食氫產(chǎn)甲烷菌和食乙酸產(chǎn)甲烷菌來說，豐富的營養(yǎng)底物可以被利用進(jìn)行代謝，此時，產(chǎn)甲烷功能基因的豐度要比環(huán)境中微生物的多樣性更為重要。Lin[24]等發(fā)現(xiàn)功能基因的多樣性提升不利于代謝途徑的有序性，并且可能帶來更多的功能冗余，在探究有關(guān)能量代謝的基因豐度變化時發(fā)現(xiàn)，甲烷代謝相關(guān)基因豐度的增加和沼氣產(chǎn)量呈正相關(guān)，與Qiang[25]等研究溫度對沼氣發(fā)酵體系影響的結(jié)果一致。雖然本研究沒有探究功能基因的多樣性與產(chǎn)氣量的關(guān)系，但處理中的甲烷代謝功能基因表達(dá)顯得更為集中。這說明氮素的添加和溫度一樣對甲烷代謝的功能基因具有調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)處理中古菌的多樣性雖然提升了，但甲烷代謝的功能基因的豐度并沒有降低，說明微生物多樣性提升和功能基因的集中表達(dá)不存在矛盾。Shade[26]等認(rèn)為微生物的多樣性只是環(huán)境微生物中一個單純的指標(biāo)，我們同樣認(rèn)為多樣性的高低不能直接說明一定的問題，復(fù)雜的代謝過程需要多種功能微生物共同參與，又或者環(huán)境中微生物多樣性低，而重要的功能微生物豐度又占據(jù)絕對優(yōu)勢，或許這正是我們想要的，但自然環(huán)境往往不是這樣的，這同樣需要在具體的環(huán)境中分析。

4 結(jié)論

(1)以玉米秸稈為原料的厭氧沼氣發(fā)酵過程中，利用16SrRNA gene和宏基因組測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，氮素添加能夠提升厭氧發(fā)酵過程中細(xì)菌的多樣性和豐度，細(xì)菌多樣性的變化特別是具備纖維素降解功能菌株豐度的提升能夠加速纖維素、半纖維素等物質(zhì)的水解和代謝過程。氮素添加和纖維素等物質(zhì)的加速分解有效的提升了反應(yīng)器內(nèi)古菌代謝所需的營養(yǎng)底物，提升了古菌的多樣性和豐度，促進(jìn)了產(chǎn)甲烷古菌的代謝和甲烷代謝基因豐度的提升。

(2)氮素添加通過提升微生物的豐度以及產(chǎn)甲烷功能基因的豐度，縮短了達(dá)到產(chǎn)氣高峰所需的周期，并在一段時間內(nèi)維持穩(wěn)定的產(chǎn)氣量和甲烷含量，最終在整個發(fā)酵周期內(nèi)顯著提升沼氣產(chǎn)氣量和TS甲烷產(chǎn)率。