季元祖，雷 穎，李曉玲，吳利紅，趙 忠

(1.甘肅省林業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊陵 712100；3.甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741020)

唐古特瑞香(Daphnetangutica)為瑞香科常綠灌木，別名陜甘瑞香、小冬青等，高0.6～1 m?；ü谕饷孀霞t色或淺紫色，內(nèi)白色，具芳香味，常數(shù)朵成頂生頭狀花序，核果紅色，卵形?；ㄆ?月，果期7月[1]。唐古特瑞香枝條婆娑，葉片常綠，開花早且花期長，花大色艷，香味濃烈，是園林綠化的良好材料。生長于海拔1 500～3 000 m的林緣山地，主要分布于甘肅省迭部、舟曲、卓尼、天水、武都、文縣等地，青海、四川、陜西等省區(qū)也有分布。其干燥莖皮及根皮入藥稱為祖師麻[2-3]，有鎮(zhèn)痛、活血、消腫、袪風(fēng)濕之用，唐古特瑞香作為民間草藥用外，還有毒魚、殺鼠和殺蟲的作用[4]，對(duì)植物病原菌也具有較強(qiáng)的抑制作用[5]。具有很高的藥用和觀賞價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊。

因繁育技術(shù)相對(duì)困難，瑞香屬樹種在生產(chǎn)實(shí)踐中人工栽培較少，一定程度影響和制約了其藥用及其他經(jīng)濟(jì)價(jià)值的利用。通過組織培養(yǎng)，可以有效解決快速繁殖技術(shù)，為有效開發(fā)利用其多種價(jià)值提供基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法具有生長周期縮短，保留原品種的優(yōu)良性狀得到無病毒植株，達(dá)到快速繁殖優(yōu)良品種的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于此方面的研究多見于金邊瑞香組織培養(yǎng)，通過利用嫩莖和莖尖[6]、葉片[7-8]進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)或離體培養(yǎng)；洪軍孟[9]以細(xì)胞分裂素6-BA和生長激素NAA兩種激素為例對(duì)金邊瑞香組織培養(yǎng)中常遇到的玻璃苗和生根問題進(jìn)行了研究；趙琦[10]等對(duì)金邊瑞香及愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，添加激素KT、NAA、BA、IAA、ZT進(jìn)行試驗(yàn)，以MS附加ZT 1.0 mg/L芽的誘導(dǎo)率最高。對(duì)于唐古特瑞香作者曾以莖尖為材料進(jìn)行過嘗試[11]，但以葉片為材料的試驗(yàn)研究，目前還未見報(bào)道。本文利用野生唐古特瑞香的幼葉為材料，進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)研究，以期建立其組織培養(yǎng)再生體系，使唐古特瑞香得到廣泛的繁殖和應(yīng)用，有效發(fā)揮其藥用和其他價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采集地點(diǎn)為甘肅省小隴山林區(qū)，采集時(shí)間為初夏，取唐古特瑞香當(dāng)年生較肥厚的嫩葉，用清水沖去表面灰塵后裝入保鮮袋備用。

1.2 方法

1.2.1 外植體表面消毒 唐古特瑞香葉片表面較為光滑，初夏采摘的肥厚嫩葉較為潔凈，取其葉片放入培養(yǎng)皿中，蓋上過濾網(wǎng)罩，流水沖洗2～3 h后，置于超凈工作臺(tái)上，放入70%的酒精中30 s后，無菌水沖洗3遍，轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中加入2滴吐溫-80不斷搖晃消毒3 min，無菌水沖洗5～6次，取出后放在鋪有濾紙的接種盤中。

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基中均加入3 %的蔗糖(生根培養(yǎng)為2%)[12]和6 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH值為5.8，愈傷誘導(dǎo)階段pH=5.6[13]；培養(yǎng)溫度為(20±2)℃，光周期12 h/12 h (光/暗)；光照強(qiáng)度：愈傷誘導(dǎo)時(shí)約30 μmol·m-2·s-1[14]，其他各階段為50 μmol·m-2·s-1。

1.2.3 除褐培養(yǎng) 除褐培養(yǎng)以MS+細(xì)胞分裂素6-BA 1.0 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的維生素C(VC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)[15]，共9個(gè)處理，1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次。每隔24 h轉(zhuǎn)瓶1次[12]，連續(xù)轉(zhuǎn)移直至褐變減輕。繼續(xù)培養(yǎng)10 d后觀察并統(tǒng)計(jì)褐變率，褐變率=褐化(死亡的)外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.4 愈傷組織培養(yǎng) 將除褐培養(yǎng)所得的材料轉(zhuǎn)接到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，遮光培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)以MS+水解酪蛋白(CH) 500 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，采用細(xì)胞分裂素6-BA與生長素2,4-D[16]的兩因素三水平隨機(jī)設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次。暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)入正常光照條件，40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，愈傷組織誘導(dǎo)率=形成細(xì)胞團(tuán)的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.5 不定芽分化培養(yǎng) 培養(yǎng)40 d后將外植體產(chǎn)生的新鮮致密的愈傷組織塊，切割成底面積約1.0 cm2的小塊，轉(zhuǎn)接到不定芽分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)以MS+生長素萘乙酸NAA 0.5 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的細(xì)胞分裂素ZT與細(xì)胞分裂素TDZ[17-18]，共9個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種1塊愈傷組織，重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)分化率和平均芽數(shù)，不定芽分化率=萌芽的愈傷組織塊/接種的愈傷組織塊×100%；平均芽數(shù)=萌芽總數(shù)/接種塊數(shù)。

1.2.6 嫩莖的增殖培養(yǎng) 將分化培養(yǎng)所得的簇生芽切下，較長嫩莖切成0.5～1.0 cm的小段，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA與生長素吲哚丁酸IBA，共9個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種3塊幼莖，重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)與平均苗高，增殖倍數(shù)=培養(yǎng)增長節(jié)位數(shù)(或芽苗數(shù))/接種時(shí)節(jié)位數(shù)(或芽苗數(shù))； 平均苗高=苗高總和/總苗數(shù)。

1.2.7 試管苗生根 當(dāng)不定芽長到2～3 cm時(shí)，切下芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長素NAA和IBA，共6個(gè)處理，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種1～2塊幼苗，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)生根率與平均根數(shù)，生根率=生根莖段數(shù)/接種莖段數(shù)×100%；平均根數(shù)=每處理生根總數(shù)/誘導(dǎo)生根的總苗數(shù)。

1.2.8 移栽 將生根的瓶苗不開蓋在煉苗室放置2～3 d，然后打開蓋再放置2～3 d，取出苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到純凈珍珠巖的基質(zhì)上，保持環(huán)境溫度約20℃，相對(duì)濕度90%～100%，適當(dāng)遮蔭，每天早晚通風(fēng)，澆灌適量營養(yǎng)液，逐漸增加光照。計(jì)算移栽成活率=移栽成活數(shù)/總移栽數(shù)×100%。

1.2.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過方差分析在F0.05水平上進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，用新復(fù)極差法(SSR)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗褐化劑對(duì)外植體褐變的影響

在超凈工作臺(tái)上將滅過菌的肥厚嫩葉剪切成0.5 cm×1.0 cm的小塊，接種到除褐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基以MS+6-BA 1.0 mg·L-1附加不同濃度配比的VC和PVP(表1)，從試驗(yàn)結(jié)果可知：MS+6-BA1.0 mg·L-1+ PVP 200 mg·L-1是較理想的除褐培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上每隔24 h轉(zhuǎn)瓶1次，連續(xù)轉(zhuǎn)移3次后發(fā)現(xiàn)褐變逐漸消失。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選擇除褐培養(yǎng)所得的長勢(shì)較好的材料轉(zhuǎn)接到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，遮光培養(yǎng)，1周后葉切塊變肥大，兩端切口處有膨大的愈傷現(xiàn)象，40 d后觀察，各處理愈傷組織塊明顯增大，但不勻一，部分愈傷塊致密、淡綠色、且表面有小疣突(圖1-D)。6-BA和2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果顯著，誘導(dǎo)率及平均直徑隨細(xì)胞分裂素6-BA和生長素2,4-D濃度的升高而增大，但當(dāng)兩者濃度分別>3.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率開始下降，愈傷組織松散透明，失去了不定芽分化能力(表2)。綜合分析表明：較為理想的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1+CH 500 mg·L-1，誘導(dǎo)率為95.5%，此培養(yǎng)基下愈傷組織塊大、致密，表面有小疣突，不定芽分化能力強(qiáng)。

表1 VC和PVP對(duì)初代培養(yǎng)中褐變的影響

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,同列數(shù)字旁不同小寫字母,表示有顯著差異(P<0.05)。表2～表5同。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：A:取材母株；B：葉切塊外植體；C:除褐后的小葉切塊愈傷化；D:分化40天的愈傷組織塊；E:不定芽分化40天；F:繼代培養(yǎng)40 d；G:生根培養(yǎng)30 d；H:移栽成活的試管苗。

圖1唐古特瑞香愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生

Fig.1 Callus induction and plantlets regeneration ofD.tangutica

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽分化的影響

將淡綠色較致密的愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，20 d后有少量不定芽產(chǎn)生，40 d長出密集的綠色不定芽(圖1-E)。由表3可見，ZT、TDZ、NAA對(duì)芽苗分化有顯著影響，不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽的分化影響不同，以添加ZT 2.0 mg·L-1、TDZ 0.1 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基較適合不定芽的分化，分化率為93.2%，平均芽數(shù)8.66個(gè)，芽苗生長健壯。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽分化的影響

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)嫩莖增殖的影響

表4顯示，6-BA與IBA對(duì)芽苗增殖的影響顯著，增殖倍數(shù)隨生長調(diào)節(jié)劑濃度的升高而增加，但當(dāng)6-BA和IBA濃度分別>2.0 mg·L-1和0.3 mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)下降，且產(chǎn)生一定數(shù)目的玻璃苗，基部有較多愈傷組織。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，唐古特瑞香芽苗增殖培養(yǎng)較適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1，芽苗生長健壯，葉色深綠，增殖倍數(shù)為12.21，平均苗高4.81 cm(圖1-F)。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)叢生芽增殖的影響

2.5 試管苗生根與移栽

叢生芽苗增殖培養(yǎng)幾代后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 d后的培養(yǎng)結(jié)果顯示：NAA和IBA均影響芽苗生根，NAA的促進(jìn)生根能力大于IBA，其中，在添加0.5 mg·L-1NAA的1/2MS培養(yǎng)基上，生根率為88.72%，平均生根數(shù)3.83條左右(圖1-G,圖1-H)，均明顯高于其他處理(表5)。將生根的試管苗移栽，20 d后成活率達(dá)90%。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)生根的影響

3 結(jié)論與討論

通常獲得再生芽都需要切口造傷[19-20]，并且不定芽往往產(chǎn)生于愈傷組織暴露于空氣中的部分，唐古特瑞香葉片內(nèi)酚類物質(zhì)含量較高，切割外植體時(shí)，切口附近細(xì)胞受到傷害，酚類化合物外溢氧化成橙黃色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)會(huì)在酶的作用下與外植體組織蛋白聚合，從而導(dǎo)致組織代謝紊亂，生長停滯[21-22]。因此，在愈傷組織誘導(dǎo)及芽苗分化培養(yǎng)前必須降低褐變的危害。不同植物對(duì)抗褐化劑的要求不同，本試驗(yàn)添加的VC和PVP對(duì)唐古特瑞香組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象具有顯著影響，PVP200 mg·L-1是降低褐變較好的濃度配比，并配合3次連續(xù)轉(zhuǎn)接，減少了褐化對(duì)愈傷分化培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)中還可以通過以下措施防止褐化：選擇旺盛生長狀態(tài)的幼嫩的外植體；葉片剪切時(shí)不能過大最好是0.5 cm×1 cm，剪口不能太多，要迅速接種以縮短在空氣中氧化的時(shí)間；選擇合適的激素和激素濃度。

激素種類和濃度對(duì)唐古特瑞香葉片愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生具有重要作用，細(xì)胞分裂素6-BA與生長素2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著影響，但細(xì)胞分裂素6-BA作用明顯大于生長素2,4-D，綜合分析顯示，MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1+CH500 mg·L-1比較適合愈傷組織誘導(dǎo)；植株再生的關(guān)鍵在于愈傷組織是否能分化出不定芽，本試驗(yàn)采用了具有較強(qiáng)活性的細(xì)胞分裂素ZT和TDZ，有效促進(jìn)了不定芽的分化，結(jié)果表明，MS+ZT 2.0 mg·L-1+TDZ 0.1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1是不定芽分化較為理想的培養(yǎng)基組合。

增殖培養(yǎng)階段，細(xì)胞分裂素6-BA與生長素IBA對(duì)芽苗的增殖都有較顯著的影響，生長素IBA較高時(shí)基部會(huì)出現(xiàn)愈傷組織而不利于增殖。MS+6-BA2.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1是芽苗增殖較適合的培養(yǎng)基組合，且當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA濃度較高時(shí)會(huì)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，該現(xiàn)象在金絲桃組培中也存在[23]。除此之外還有其他一些因素與玻璃化苗的出現(xiàn)有一定關(guān)系：外植體部位、大小、培養(yǎng)基不同激素和不同激素濃度、銨根硝酸根濃度、瓊脂濃度等?？梢赃m當(dāng)在保證組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上降低激素濃度；用細(xì)胞分裂素KT代替細(xì)胞分裂素BA用于唐古特瑞香的組培苗增殖；增加瓊脂用量等措施來降低玻璃苗的產(chǎn)生。增加生產(chǎn)的穩(wěn)定性，降低無效苗的消耗。

物理結(jié)構(gòu)較好，保水通透性能好的基質(zhì)是移栽成活的基本條件，生根過程中，1/2MS+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，有利于根原基的形成，唐古特瑞香存在移栽困難的問題，移栽時(shí)采用純凈珍珠巖、蛭石基質(zhì)，適量澆灌營養(yǎng)液可提高試管苗的移栽成活率。