郭 娟，邱 帥，劉華紅，魏建芬，陳徐平，陳林敬，盧 山

(1.杭州市園林綠化股份有限公司，浙江 杭州 310020；2.浙江理工大學(xué) 建筑工程學(xué)院，浙江 杭州 310018)

冬青屬(Ilex)為冬青科(Aquifoliaceae)一大屬，樹形整齊、樹冠優(yōu)美，果實通常紅色光亮，經(jīng)冬不落，分外艷麗，極具觀賞價值，全世界400多種，我國200多種[1]。目前，對冬青屬植物的報道主要集中在冬青的分類[2-3]、繁育[4-5]、園藝應(yīng)用[3-4,6]及遺傳多樣性[7]等方面的研究。在歐美國家，雜交冬青已成為園林綠化中十分重要的觀賞樹種，而我國對冬青屬植物雜交育種尚未有報道。因此，通過雜交育種的方法培育冬青新品種意義重大。冬青屬不同植物花期相差較遠，最多可達數(shù)月，經(jīng)過長期貯藏后，花粉能否保持較高生活力是冬青雜交成敗的關(guān)鍵。除了不同種之間的遺傳差異外，貯藏條件是影響花粉生活力的重要因素，其中溫度和濕度尤為重要[8]。研究表明[8-10]，低溫低濕條件下，多數(shù)植物的花粉都能貯藏較長時間并保持生活力，但少見冬青屬植物相關(guān)研究?；ǚ凵盍χ饕w現(xiàn)在花粉萌發(fā)率和花粉管長度兩個方面[11]。離體培養(yǎng)提供的花粉萌發(fā)條件與花粉在柱頭上的萌發(fā)條件較為接近，且數(shù)據(jù)可靠亦可定量是目前花粉生活力測定的首選方法[12-13]。離體培養(yǎng)在杏[14]、山玉蘭[12]、紅山茶[15]、石榴[16]等植物研究中都有應(yīng)用，但不同植物的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基組分存在較大差異。

本研究通過對4種冬青屬植物進行以蔗糖、H3BO3、Ca2+為變量設(shè)計的正交試驗L25(53)研究，探討4種冬青屬植物花粉體外萌發(fā)的最適液體培養(yǎng)基，并對花粉體外萌發(fā)動態(tài)進行細胞學(xué)觀測；研究不同貯藏條件對花粉萌發(fā)率及花粉管生長的影響，為冬青雜交育種提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料于2017年3-4月采自杭州植物園、杭州市園林綠化股份有限公司青山基地和徑山基地，采集生長健壯的冬青屬4個種的成年植株 (表1)。采集大蕾期的花枝，帶回實驗室水培，選擇含苞待放的花蕾，剪去花被片，將花藥散落在硫酸紙上，放入硅膠干燥器中充分干燥，待花粉完全散出后及時收集到2 mL離心管中用于花粉培養(yǎng)基選擇及花粉貯藏試驗。冬青屬各品種開花期不一致，試驗依據(jù)開花時間依次進行，處理方法一致。

表1 4種冬青屬植物花粉的采集

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉離體萌發(fā)法 采用液體培養(yǎng)法，以蔗糖(0%、5%、10%、15%、20%)、H3BO3(0.000%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%)、CaCl2(0.000%、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%)進行3因素5水平共25個組合L25(53)的正交試驗，以萌發(fā)率和花粉管長度為指標(biāo)，以短梗冬青為材料進行初步篩選，其余3個品種從較優(yōu)組合中再篩選出各自的最佳培養(yǎng)基組合。參考張超儀[17]的方法，在雙孔凹型載玻片孔內(nèi)各滴入1滴培養(yǎng)液，用毛筆將花粉均勻點入培養(yǎng)液中，將載玻片放入保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25℃人工氣候箱中暗培養(yǎng)4 h。在40×顯微鏡下觀察統(tǒng)計，花粉管長度超過花粉粒直徑即視為已萌發(fā)，每處理統(tǒng)計至少10個視野，每個視野花粉不少于50粒。計算公式：萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。使用Motic BA 400生物顯微鏡數(shù)碼顯微圖像系統(tǒng)隨機對花粉管進行長度測量，每處理隨機選擇10根花粉管測量?；ǚ酃荛L度計數(shù)單位為1 D=1倍的花粉粒直徑。

1.2.2 花粉的貯藏 以上述干燥的花粉作為試驗材料，每2 g分裝于2 mL離心管內(nèi)密封保存，并置于4℃、-20℃ 2種不同條件下貯藏。每隔0、2、7、14、21、28、35、42、49、56 d和180 d取出一部分花粉，使用篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀測是否有萌發(fā)率。試驗操作步驟、培養(yǎng)條件及統(tǒng)計方法同上述離體培養(yǎng)法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計每個視野冬青花粉萌發(fā)率、花粉管長度，用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，用SPSS 19.0軟件進行方差分析，使用R語言corrplot包進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖、H3BO3和CaCl2對冬青花粉萌發(fā)的影響

短梗冬青花粉萌發(fā)正交試驗均值(表2)表明，不同濃度的蔗糖、H3BO3和CaCl2對花粉萌發(fā)率的影響存在差異(P<0.05)。隨著蔗糖濃度的增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。蔗糖濃度為0%時，花粉萌發(fā)率最低，蔗糖濃度處于5%～10%時，萌發(fā)率逐漸升高，當(dāng)蔗糖濃度為10%時，花粉萌發(fā)率達到最大值，均值7.88%，蔗糖濃度在10%～20%時，花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度升高而迅速降低，其中蔗糖濃度20%時，部分花粉發(fā)生質(zhì)壁分離，萌發(fā)率均值為2.55%，表明高濃度蔗糖對花粉萌發(fā)有一定的抑制作用，有效促進花粉萌發(fā)的蔗糖濃度為5%～10%。隨著H3BO3濃度的增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。H3BO3濃度在0.000%～0.002%，短梗冬青花粉萌發(fā)率隨著濃度升高而迅速上升，H3BO3濃度為0.002%時萌發(fā)率達到最大值，萌發(fā)率平均8.77%，H3BO3濃度>0.002%時，花粉萌發(fā)率下降，在0.004%～0.008%，萌發(fā)率無顯著差異，表明低濃度的H3BO3對花粉萌發(fā)率的促進作用顯著高于高濃度，適宜的H3BO3濃度為0.002%。隨著CaCl2濃度的增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)下降趨勢。CaCl2濃度為0%時，花粉萌發(fā)率最高，平均值為9.08%，當(dāng)CaCl2濃度>0%時，花粉萌發(fā)率迅速下降，CaCl2濃度在0.005%～0.020%，花粉萌發(fā)率無顯著差異，表明CaCl2的加入會抑制短梗冬青花粉的萌發(fā)率。

短梗冬青花粉萌發(fā)正交試驗均值(表2)表明，不同濃度的蔗糖、H3BO3和CaCl2對花粉管長度生長的影響存在差異(P<0.05)。隨著蔗糖濃度的增加，花粉管長度整體表現(xiàn)為增加趨勢，但差異不顯著，其中蔗糖濃度20%時，花粉管長度達到最大值，均值5.27 D。隨著H3BO3濃度增加，花粉管長度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，H3BO3濃度在0.000%～0.004%時，花粉管長度迅速增加，H3BO3濃度為0.004%時，花粉管長度達到最大值，均值為5.89 D，H3BO3濃度在0.004%～0.008%時，花粉管長度逐漸減短，但仍然高于對照值(H3BO3濃度為0.000%)，表明H3BO3促進花粉管生長，低濃度的促進作用高于高濃度。隨著CaCl2濃度的增加，短梗冬青花粉管表現(xiàn)為先減后增，CaCl2濃度為0.00%時，花粉管長度達到最大值，均值為5.17 D，CaCl2濃度為0.000%～0.010%時，花粉管長度逐漸減短，0.010%時花粉管長度最短，均值為3.55 D，當(dāng)CaCl2濃度為0.010%～0.020%時花粉管長度逐漸增加，0.020%時花粉管長度為4.23D，CaCl2濃度為0.005%～0.020%時花粉管長度無顯著差異，表明CaCl2的加入對短梗冬青花粉管生長有一定的抑制作用。

表2 不同因素水平對短梗冬青花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列相同小寫字母表示0.05水平差異不顯著。下同。

2.2 花粉最適培養(yǎng)基篩選

短梗冬青花粉正交試驗均值(表2)表明，蔗糖濃度處于5%～10%，硼酸濃度處于0.002%～0.006%，CaCl2為0.000%時，花粉萌發(fā)率與花粉管長度生長均處于較高水平。正交試驗方差分析表明(表3)， 蔗糖濃度處于5%～15%，均有花粉萌發(fā)率與花粉管長度值顯著高于同濃度的其他處理，花粉管長度在蔗糖濃度20%時取的最大值，但由于蔗糖濃度較高，導(dǎo)致部分花粉質(zhì)壁分離，所以該濃度并不是花粉萌發(fā)的適宜濃度。因此，結(jié)合花粉萌發(fā)率和花粉管長度值，選出萌發(fā)率值較高，花粉管長度較長，表現(xiàn)出較高活力的6個處理，分別為處理8、處理9、處理12、處理14、處理17和處理20作為其余3種冬青屬植物花粉萌發(fā)的液體培養(yǎng)基進行篩選。以上試驗結(jié)果表明：由正交試驗均值選出的蔗糖、H3BO3和CaCl2各自的較優(yōu)水平組合的培養(yǎng)基，與正交設(shè)計方差分析結(jié)果選出的較優(yōu)處理并不完全一致，這可能與正交試驗中不同因素組合對花粉萌發(fā)率與花粉管長度生長的影響有別于單因素影響有關(guān)。正交試驗均值的影響表現(xiàn)為，在正交表中蔗糖、H3BO3和CaCl2的任一水平下都均衡地包含著另外2個因素的5個水平，當(dāng)比較某因素不同水平時，其它因素的效應(yīng)均可彼此抵消，因此，不同因素的各水平差異均由該因素引起。

3種冬青方差分析結(jié)果(表4)表明：全緣冬青花粉在處理12中萌發(fā)率最高，且花粉管長度生長良好，顯著高于其余的4個組合；大葉冬青花粉在處理14中萌發(fā)率及花粉管長度都顯著高于其他組合；大別山冬青花粉在處理9中萌發(fā)率及花粉管長度都顯著高于其他組合。綜合得出：短梗冬青、全緣冬青花粉最適培養(yǎng)基為處理12、大葉冬青為處理14、大別山冬青為處理9。

表3 短梗冬青花粉在正交試驗中的萌發(fā)率和花粉管長度

表4 3種冬青花粉最適培養(yǎng)基的篩選

2.3 不同貯藏條件對冬青花粉生活力影響

2.3.1 不同貯藏條件對冬青花粉萌發(fā)率的影響 由圖1A可知，總體上，在4℃和-20℃貯藏條件下，冬青花粉萌發(fā)率隨時間的增加表現(xiàn)為先降后升再降的趨勢，相同培養(yǎng)時間，在2種貯藏條件下的花粉萌發(fā)率無顯著差異，但-20℃最大值較4℃高，隨著時間增加花粉萌發(fā)率下降趨勢較4℃緩慢。由圖1a可知，在2種條件下，短梗冬青花粉貯藏2 d，花粉萌發(fā)率顯著降低，貯藏2～14 d期間萌發(fā)率也有小幅度下降，貯藏14～28 d花粉萌發(fā)率顯著升高，其中在-20℃條件下，貯藏28 d時萌發(fā)率達到最大值72.74%，顯著高于4℃條件，隨后下降，180 d花粉萌發(fā)率降至14.23%，在4℃條件下，花粉萌發(fā)率持續(xù)上升，貯藏42 d時花粉萌發(fā)率達到最高56.88%，隨后下降，180 d萌發(fā)率降至4.07%，表明短梗冬青更適合在-20℃條件下貯藏。由圖1b可知，全緣冬青花粉在2種貯藏條件下先增后減的趨勢是一致的，但萌發(fā)率最大值4℃條件下顯著高于-20℃，在花粉貯藏7～28 d期間萌發(fā)率均表現(xiàn)為4℃條件下顯著高于-20℃條件，在貯藏35～180 d期間2種條件下萌發(fā)率無顯著差異，49 d除外，4℃條件下花粉貯藏7 d萌發(fā)率達到最大值21.66%，在-20℃條件下，貯藏14 d時達到最大值15.24%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，56 d花粉萌發(fā)率都降至4%以下，結(jié)果表明4℃更適合全緣冬青花粉的短期貯藏。由圖1c可知，大葉冬青花粉萌發(fā)率在2種貯藏條件下貯藏7～42 d期間均表現(xiàn)為緩慢上升，4℃條件下貯藏7～42 d期間的花粉萌發(fā)率均顯著高于-20℃條件下的花粉萌發(fā)率，貯藏42 d時萌發(fā)率均達到最高，4℃條件下貯藏的花粉萌發(fā)率為14.66%，-20℃條件下為10.23%，隨后4℃條件下貯藏的花粉萌發(fā)率迅速下降，56 d降至3.53%，180 d活力為0，-20℃條件貯藏的花粉活力下降較緩慢，180 d花粉仍有一定活力，萌發(fā)率為2.30%，結(jié)果表明，4℃適合大葉冬青花粉短期內(nèi)保存，-20℃則適合較長時間的花粉活力保存。由圖1 d可知，大別山冬青花粉在2種貯藏條件下，貯藏2 d時萌發(fā)率均達到最高，4℃條件下貯藏的花粉萌發(fā)率為10.01%，-20℃條件下貯藏的花粉萌發(fā)率為10.95%，隨后花粉活力迅速下降，貯藏7 d時均已降至5%以下，表明大別山冬青花粉活力下降速度較快，2種貯藏條件下花粉萌發(fā)率無顯著差異。

2.3.2 不同貯藏條件對冬青花粉管生長的影響 由圖2A可知，總體上，在4℃和-20℃貯藏條件下，4種冬青花粉管長度隨著貯藏時間增加都表現(xiàn)為先增后減，4℃條件下花粉管長度最大值顯著高于-20℃，但-20℃條件下隨著時間增加花粉管長度減短趨勢較4℃緩慢。由圖2a可知，短梗冬青花粉在4℃條件下貯藏0～42d期間花粉管長度先增后降，35 d達到最大值15.77 D，42～56 d期間長度維持在12～13 D，差異不顯著，180 d花粉管長度僅有2.41 D；在-20℃條件下，貯藏7～56 d期間花粉管長度維持在10.82～12.81 D，差異不顯著，由此看出，-20℃貯藏條件下的短梗冬青花粉管在較長一段時間內(nèi)生長保持一致。由圖2b可知，全緣冬青花粉在2種貯藏條件下，花粉管長度變化趨勢較為一致，在4℃條件下，貯藏21 d時花粉管長度達到最大值12.51 D，在-20℃條件下，貯藏2 d時花粉管長度達到最大值14.27 D，隨后均呈現(xiàn)下降趨勢，-20℃條件下隨著貯藏時間的延長花粉管長度減短趨勢較4℃條件下緩慢，21～56 d花粉管長度顯著高于4℃條件。由圖2c可知，大葉冬青花粉在2種貯藏條件下，花粉管長度變化趨勢較一致，均表現(xiàn)為先增后減，在貯藏0～49 d期間花粉管長度均高于10 D，4℃條件下，貯藏21 d時花粉管長度達到最大值22.44 D，-20℃條件下，貯藏14 d時花粉管長度達到最大值22.96 D，隨后下降，貯藏56 d時，花粉管長度均降至10 D以下，表明在2種貯藏條件下，大葉冬青花粉均可保持較高的活力。由圖2d可知，大別山冬青新鮮花粉的花粉管長度達到最大值，13.94 D，隨后下降，貯藏0～7 d時花粉管長度在2種條件下表現(xiàn)一致，貯藏14～49 d期間，-20℃貯藏條件下花粉管長度減短趨勢較4℃條件緩慢，貯藏21～28 d期間花粉管長度顯著高于4℃條件，35 d后花粉管長度都降至3 D以下，表明大別山冬青花粉活力下降較快。

注：圖A表示4種冬青花粉萌發(fā)率在4℃和-20℃ 2種貯藏條件下總體表現(xiàn)；圖a～圖d分別表示短梗冬青、全緣冬青、大葉冬青和大別山冬青花粉萌發(fā)率在4℃和-20℃貯藏條件下的變化。誤差線為95%置信區(qū)間，相互重疊表示無顯著差異，反之則差異顯著。

圖12種貯藏條件對4種冬青花粉萌發(fā)率的影響

Fig.1 Effect of 2 storage temperatures on pollen germination rate of 4Ilexspecies

注:圖A表示4種冬青花粉管長度在4℃和-20℃2種貯藏條件下總體表現(xiàn)；圖a～圖d分別表示短梗冬青、全緣冬青、大葉冬青和大別山冬青花粉管長度在4℃和-20℃貯藏條件下的變化。誤差線為95%置信區(qū)間，相互重疊表示無顯著差異，反之則差異顯著。

圖22種貯藏條件對4種冬青花粉管生長的影響

Fig.2 Effect of 2 storage temperatures on pollen tube growth of 4Ilexspecies

2.4 花粉萌發(fā)率與花粉管生長動態(tài)相關(guān)性分析

對4種冬青花粉萌發(fā)率與花粉管長度進行相關(guān)性分析，由圖3可以看出，總體上，4種冬青花粉萌發(fā)率與花粉管長度為弱正相關(guān)性，但不同貯藏溫度下，不同冬青的兩者相關(guān)性有較大差異。其中，大別山冬青在4℃和-20℃條件下花粉萌發(fā)率與花粉管長度均為強正相關(guān)，表明花粉管長度的增減趨勢與花粉萌發(fā)率變化一致；大葉冬青的花粉萌發(fā)率與花粉管長度總體為正相關(guān)，但在4℃條件下相關(guān)性較強，-20℃為弱相關(guān)，4℃條件下萌發(fā)率高且花粉管長度長，-20℃條件下，花粉管最大值較萌發(fā)率最大值提前，表明大葉冬青在貯藏前期4℃條件下的花粉生活力更高；短梗冬青花粉在4℃和-20℃ 2種條件下萌發(fā)率與花粉管長度為正相關(guān)，相關(guān)性強弱差異不大，但在4℃條件下，花粉管的長度增減幅度較-20℃明顯，-20℃萌發(fā)率高，且花粉管長度保持一致，表明在4℃條件下對花粉活力影響明顯，20℃條件下，花粉活力保持更好；全緣冬青花粉總體上表現(xiàn)為二者弱相關(guān)性，其中在4℃條件相關(guān)性強于-20℃，相同時期，-20℃條件下，花粉萌發(fā)率較4℃低，但花粉管長度較4℃長，表明2種條件對全緣冬青花粉活力的影響有差異。

注：r介于-1和1，r=1，表示2個變量完全正相關(guān)，r=0時表示兩變量非線性相關(guān)，r=-1時表示2個變量完全負相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

研究表明離體萌發(fā)法對所有花粉均適宜，大多數(shù)植物都采用離體萌發(fā)法來測定花粉活力與萌發(fā)特性[15]?；ǚ垭x體萌發(fā)受多種因素影響，其中蔗糖、硼酸和Ca2+是影響花粉萌發(fā)的重要因素。蔗糖為花粉萌發(fā)和花粉管形成提供必需的碳源和能量，調(diào)節(jié)花粉粒內(nèi)外滲透壓平衡[18]，不同種類的植物花粉萌發(fā)所需蔗糖濃度不同，同種植物不同品種間花粉適宜的蔗糖濃度亦存在差異[14]。本研究中，4種冬青屬植物花粉萌發(fā)適宜的蔗糖濃度為5%～10%，其中短梗冬青、全緣冬青、大葉冬青適宜的蔗糖濃度為10%，大別山冬青為5%，濃度過低則萌發(fā)率較低，過高則抑制萌發(fā)甚至導(dǎo)致花粉細胞質(zhì)壁分離，但蔗糖并非冬青花粉萌發(fā)的必要條件，在不添加蔗糖的溶液里仍有一定的萌發(fā)率，這與張超儀[17]對杜鵑花屬植物的研究結(jié)果一致。硼酸影響花粉管的生長和形態(tài)，主要參與花粉管頂端細胞壁的構(gòu)建[19]，影響花粉管的生長。通?；ǚ壑械呐鹚岷坎蛔?，需要柱頭和花柱中的硼來補充，因此離體培養(yǎng)條件下均需添加一定量的硼酸來促進花粉萌發(fā)[11]。本研究中，低濃度的硼酸顯著促進了短梗冬青(0.002%)、全緣冬青(0.002%)和大別山冬青(0.006%)，大葉冬青(0.006%)花粉萌發(fā)，硼酸濃度為0.000%時，花粉沒有萌發(fā)，硼酸濃度較高時(0.008%)，促進作用減弱，這與山玉蘭[12]、遼寧楊[13]花粉萌發(fā)所需低濃度的硼酸較為接近。另外，鈣在花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中也起一定作用，一定濃度的Ca2+是花粉萌發(fā)所必需的，外源Ca2+的需求取決于花粉細胞內(nèi)游離鈣的含量，內(nèi)源鈣充足時，Ca2+的添加可能造成細胞Ca2+中毒，產(chǎn)生過高的細胞膨壓，從而抑制花粉的萌發(fā)及花粉管的生長[20-22]。外源鈣可以替代花粉萌發(fā)時的群體效應(yīng)[23]，促進花粉萌發(fā)。本研究結(jié)果顯示，CaCl2的加入顯著抑制了短梗、全緣、大別山冬青花粉的萌發(fā)和花粉管的生長，但對大葉冬青有促進作用，表明前者細胞內(nèi)Ca2+含量可能相對較高，而后者細胞內(nèi)源Ca2+不足。這與張超儀[17]對杜鵑花屬植物花粉萌發(fā)率的研究結(jié)果較為一致，CaCl2的加入抑制了部分杜鵑品種花粉的萌發(fā)。

由于遺傳差異，不同植物新鮮花粉生活力不同，而合適的貯藏條件是花粉能否長期保持活力的關(guān)鍵因素。因此，明確貯藏條件對不同植物花粉生活力的影響對解決花期不遇的植物雜交有著重要的指導(dǎo)意義。一般花粉貯藏溫度有常溫、4、-20、-70、-80、-196℃[24-26]。由于無需特殊設(shè)備，易于實現(xiàn)，常溫、4 ℃和-20℃是實際生產(chǎn)過程經(jīng)常用到的。本試驗結(jié)果表明： 4種冬青花粉生活力在-20℃較4℃條件下保存時間長，其中短梗冬青花粉在2種條件下貯藏180 d仍有一定的活力，-20℃條件下活力較高；全緣冬青、大葉冬青花粉在4℃可貯藏2個月左右，貯藏56 d萌發(fā)率都降至4%以下，-20℃條件下貯藏180 d時仍有一定的活力，分別為0.9%和2.3%；大別山冬青相比較其余3種冬青花粉保存時間較短，貯藏7 d時，花粉萌發(fā)率都降至5%以下。一般來說，花粉生活力會隨著貯藏時間的延長而下降，而本試驗表明，4種冬青花粉的萌發(fā)率在短時間貯藏后顯著增加，這可能與采收的新鮮花粉干燥時未充分散粉，在貯藏的過程中除了花粉的代謝活動，還有花粉的散出，到一定時間，花粉量達到最大值，從而出現(xiàn)萌發(fā)率最大值的現(xiàn)象有關(guān)。這一現(xiàn)象在油茶[10]、紫薇[27]和板栗[28]中都有報道，其他原因仍需進一步研究。花粉萌發(fā)率達到峰值后，之后隨著時間的延長，活力逐漸下降，其中-20℃下降的趨勢較4℃緩慢，這可能與花粉在低溫貯藏條件下可溶性糖類和有機酸類消耗較少，從而花粉生活力下降得較慢有關(guān)[29]。

萌發(fā)率和花粉管長度常用來鑒定花粉的生活力。本研究表明，短梗冬青、大葉冬青和大別山冬青在2種貯藏條件下，花粉管長度總體變化趨勢與花粉萌發(fā)率較為一致，而全緣冬青花粉在-20℃條件下儲藏，前期花粉萌發(fā)率較4℃低，但相同時間的花粉管長度高于4℃條件，且貯藏期間花粉管長度增減幅度較小，張紹鈴[30]認(rèn)為，與萌發(fā)率相比，花粉管長度更能展現(xiàn)生活力，并與受精密切相關(guān)。從冬青雜交試驗來看，即使萌發(fā)率低于5%，而花粉管較長，依然有一定的結(jié)實率，在一定程度上證明了張紹鈴的結(jié)論，但依然需要進一步明確花粉管長度與結(jié)實率的關(guān)系。

綜上可得，短梗冬青和全緣冬青花粉離體培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.002% H3BO3，大葉冬青花粉適宜的培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.006% H3BO3+0.010% CaCl2，大別山冬青為5%蔗糖+0.006% H3BO3；不同冬青的花粉生活力存在顯著差異，短梗冬青>全緣冬青>大葉冬青>大別山冬青；短時間低溫貯藏能夠有效提高冬青花粉生活力；短時間貯藏，-20℃和4℃條件下，冬青花粉生活力變化差異不顯著，而長時間貯藏，-20℃條件下生活力高于4℃；2種貯藏條件下，短梗冬青花粉貯藏時間最長，180 d仍有較高生活力，全緣冬青和大葉冬青次之，大別山冬青花粉貯藏時間最短，7 d之后活力均降到5%以下；短梗冬青和全緣冬青花期較早，花粉貯藏時間較長，適合作為冬青屬種間雜交的父本，而大葉冬青和大別山冬青花期較晚，花粉生活力喪失較快，適合作為母本。