張歡歡，林麗萍*，王嬌燕

1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院放射科，上海 200240；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院放射科，上海 200021；

膠質(zhì)瘤是腦內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，根據(jù)惡性程度不同，分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤（I～I(xiàn)I級(jí)）及高級(jí)別膠質(zhì)瘤（III～I(xiàn)V級(jí)）。膠質(zhì)瘤的準(zhǔn)確分級(jí)對(duì)治療決策、療效檢測(cè)和管理以及預(yù)后評(píng)估具有重要臨床意義[1]。紋理分析技術(shù)可快速地從影像圖像提取定量特征數(shù)據(jù)，并對(duì)其進(jìn)行分析、建模和分類(lèi)，可用于輔助鑒別診斷良惡性病變、評(píng)估腫瘤的侵襲、分級(jí)與分期、治療療效和預(yù)測(cè)預(yù)后等[2-5]。但由于醫(yī)學(xué)圖像及其紋理特征的復(fù)雜性，不同特點(diǎn)的醫(yī)學(xué)圖像需要采用有針對(duì)性的最合理紋理分析方法[6]。同時(shí)，特定的磁共振紋理特征與腫瘤亞型之間的關(guān)系尚不明確[7]。為探究適合膠質(zhì)瘤分級(jí)的最佳紋理分析方法，以及分析紋理特征與膠質(zhì)瘤級(jí)別之間的相關(guān)性，本研究通過(guò)建立穩(wěn)定可靠、接近人腦膠質(zhì)瘤特性的大鼠膠質(zhì)瘤模型，從MRI圖像中提取特征，采用影像組學(xué)的處理流程，進(jìn)行高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤的紋理分析研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 雄性 Wistar大鼠 35只，體重250～300 g，SPF級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)于上海生命科學(xué)研究院，在RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。于細(xì)胞處于狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期，配制成濃度為106個(gè)/μl的細(xì)胞懸液。大鼠麻醉消毒后，俯臥位固定于立體定向儀上，于顱中線行2～3 cm切口，用微型手持式顱鉆在冠狀縫前1 mm、矢狀縫右側(cè)3 mm處鉆一骨孔。微量進(jìn)樣器經(jīng)骨孔垂直進(jìn)針至硬膜下6 mm，后退1 mm，以1 μl/min緩慢推注，10 min推注完畢，留針10 min，緩慢退針，骨蠟封閉，單籠飼養(yǎng)。

1.2 MRI檢查 大鼠分別于接種后 7、14、21 d行MRI檢查。21 d后存活大鼠出現(xiàn)精神萎靡、抽搐、偏癱、眶周淤血等瀕死狀態(tài)時(shí)，立即行MRI檢查。所選大鼠掃描前以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉備用。MRI檢查采用Siemens 3.0T Skyra醫(yī)用MR掃描儀，配小動(dòng)物專(zhuān)用線圈，以視交叉為中心，序列：軸位SE-T1WI、FSE-T2WI、T2-FLAIR及軸位T1WI增強(qiáng)掃描。掃描參數(shù)為，T1WI序列：TR 350 ms，TE最小值，激勵(lì)次數(shù)（NEX）4；T2WI序列：TR 3 000 ms，TE 120 ms，NEX 4；T2-FLAIR 序列：TR 9000 ms，TE 155 ms，NEX 1；增強(qiáng)掃描：腹腔注射0.15 g/ml釓噴替酸葡甲胺（3 ml/kg）后約20 min掃描。掃描視野均為8 cm×8 cm，層厚3.0 mm，層間距0，矩陣192×192。

1.3 病理學(xué)檢查 每次MRI檢查后，采用隨機(jī)數(shù)表法抽取6只大鼠以4%多聚甲醛溶液心臟灌注固定全腦，開(kāi)顱取全腦，將所有標(biāo)本投入 4%多聚甲醛溶液繼續(xù)固定24 h。以視交叉為參照，行0.3 μm常規(guī)病理切片，行HE染色及GFAP免疫組化檢查，按WHO膠質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)確定其病理級(jí)別。

1.4 紋理分析 采用 MaZda軟件（4.6版，http://www.eletel.p.lodz.pl/programy/mazda/）進(jìn)行圖像紋理分析。

1.4.1 感性興趣（ROI）的選擇 將 MRI圖像以DICOM格式導(dǎo)出至紋理分析軟件MaZda。在神經(jīng)影像學(xué)專(zhuān)家指導(dǎo)下，以T1WI增強(qiáng)圖像作為參照確定腫瘤邊界，勾畫(huà)ROI。若腫瘤強(qiáng)化不明顯，則以T2WI圖像確定邊界。各序列（T1WI、T2WI、FLAIR 和 T1WI增強(qiáng)）ROI保持一致。不同序列上ROI之間的差異通過(guò)計(jì)算其面積的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）評(píng)價(jià)，ICC>0.80為一致性佳，ICC0.61～0.80為一致性中等，ICC0.41～0.60為一致性一般，ICC0.11～0.40為一致性較低，ICC<0.10為無(wú)一致性。為更全面地分析病灶紋理特征，各序列上選擇病灶較大的2個(gè)層面用于后續(xù)分析。

1.4.2 紋理特征計(jì)算 所有圖像在提取特征參數(shù)前行灰度標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)灰度變換法增強(qiáng)紋理信息的可檢測(cè)性。MaZda使用3種特征計(jì)算方法：統(tǒng)計(jì)學(xué)、基于模型、圖像變換，每個(gè)圖像最終得到6組（直方圖、絕對(duì)梯度、共生矩陣、游程矩陣、自回歸模型、小波變換）近400個(gè)紋理特征數(shù)據(jù)。

1.4.3 紋理特征選擇和提取 MaZda軟件自帶 4種獨(dú)立的方法，可自動(dòng)選擇有價(jià)值的紋理特征，包括特征子集選擇（optimal subsets，OS）、費(fèi)希爾系數(shù)（fisher score，F(xiàn)S）、分類(lèi)錯(cuò)誤概率聯(lián)合平均相關(guān)系數(shù)（probability of classification error and average correlation coefficients，PA）、互信息系數(shù)（mutual information，MI），以上每種方法可以自動(dòng)選擇10個(gè)最具價(jià)值的特征參數(shù)，后 3種方法聯(lián)合應(yīng)用（MI+PA+FS）可以提供30個(gè)特征參數(shù)。將選擇的特征參數(shù)進(jìn)一步進(jìn)行特征提取，在B11模塊中通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和非線性判別分析（nonlinear discriminant analysis，NDA）進(jìn)行數(shù)據(jù)降維。

1.4.4 紋理分類(lèi) PCA和LDA數(shù)據(jù)以B11模塊中的K近鄰算法（k-nearest neighbor，K-NN， K=1）分類(lèi)器進(jìn)行分類(lèi)，NDA數(shù)據(jù)通過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）分類(lèi)器進(jìn)行分類(lèi)。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)雙向無(wú)序R×C表比較5種特征選擇方法（OS、FS、PA、MI、MI+PA+FS）分別通過(guò) 3種特征提取/分類(lèi)方法（PCA/K-NN、LDA/KNN、NDA/ANN）得出的最小誤判率。在最佳分類(lèi)序列上所篩選出誤判次數(shù)最低的紋理特征組，通過(guò)SPSS 22.0軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤各特征參數(shù)間是否存在差異，將單因素分析得出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的特征參數(shù)納入二元Logistic回歸模型進(jìn)一步分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作特性（ROC）曲線比較與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)相關(guān)的紋理特征對(duì)膠質(zhì)瘤分級(jí)的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 大鼠膠質(zhì)瘤模型MRI表現(xiàn) 對(duì)35只大鼠實(shí)施立體定向接種，排除未成瘤及圖像質(zhì)量不佳病例，共32只荷瘤大鼠的MRI圖像納入分析。接種早期，腫瘤呈小結(jié)節(jié)狀或條狀異常信號(hào)，T1WI上呈等或稍高信號(hào)，T2WI及T2 FLAIR上呈稍高信號(hào)，增強(qiáng)掃描后強(qiáng)化不明顯。第2周起腫瘤明顯增大，信號(hào)不均勻，境界不清，部分病灶內(nèi)見(jiàn)點(diǎn)狀出血信號(hào)。第 3～4周腫瘤明顯增大，占位效應(yīng)明顯，晚期腫瘤信號(hào)混雜，內(nèi)可見(jiàn)壞死、出血信號(hào)，增強(qiáng)掃描后呈明顯不均勻環(huán)形強(qiáng)化（圖1A～D）。

圖1 接種C6細(xì)胞后第3周大鼠MRI掃描圖像及病理圖像，腫瘤位于大鼠右側(cè)大腦半球。T1WI示腫瘤呈等-稍高信號(hào)（星號(hào)），邊界不清（A）；T2WI示腫瘤以高信號(hào)為主，內(nèi)可見(jiàn)斑點(diǎn)狀低信號(hào)區(qū)（箭，B）；FLAIR示腫瘤周?chē)?jiàn)斑片狀水腫（箭，C）；T1WI增強(qiáng)示腫瘤呈環(huán)形強(qiáng)化，中央壞死（箭頭）未強(qiáng)化（D）；HE染色示病灶周?chē)?jiàn)較多腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，正常神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞間隙增寬，瘤周間質(zhì)水腫（×40，E）；GFAP免疫組織化學(xué)染色示棕黃色部分即為腫瘤GFAP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域（×200，F(xiàn)）

2.2 病理結(jié)果 光鏡下顯示腫瘤細(xì)胞聚集、排列緊密、生長(zhǎng)活躍，與正常組織交界處可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1E）。免疫組化顯示腫瘤組織內(nèi)見(jiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞（圖1F）。按照WHO膠質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，本研究32例大鼠膠質(zhì)瘤模型，其中 I～I(xiàn)I級(jí) 15例（低級(jí)別組），III～I(xiàn)V級(jí)17例（高級(jí)別組）。

2.3 紋理分析結(jié)果 64個(gè)層面的圖像均包含4個(gè)序列，共256幅圖像納入分析，其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤120幅，高級(jí)別膠質(zhì)瘤136幅。各序列上ROI之間的ICC值為0.925（95%CI0.890～0.950，P<0.01）。5種紋理特征選擇方法篩選出的紋理參數(shù)主要集中在共生矩陣、游程矩陣和直方圖，見(jiàn)表1。

表1 5種自動(dòng)選擇方法在MRI各序列上篩選出具有價(jià)值的紋理特征參數(shù)的個(gè)數(shù)

紋理提取和分類(lèi)結(jié)果顯示，T2WI圖像提取的特征對(duì)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤有較好的分類(lèi)能力（圖2A），低于3%的誤判率出現(xiàn)7次，其次分別為T(mén)1WI（5次）、增強(qiáng)T1WI（3次）和FLAIR（1次）。

紋理特征選擇方法中，PA法及MI+PA+FS法較其他3種單一的特征選擇方法（OS、FS、MI）誤判率更低，前兩者在T2WI圖像特征得出的誤判率相近（0/64～1/64），但其余各序列（T1WI、FLAIR、增強(qiáng)T1WI）中MI+PA+FS法選擇紋理特征得出的誤判率更低（1/64）（圖2B）。

圖2 紋理分析。A為各MRI掃描序列圖像通過(guò)不同方法所得誤判率；B為5種紋理特征選擇方法所得誤判率；C為通過(guò)3種方式進(jìn)行紋理特征提取和分類(lèi)后所得誤判率。FS為費(fèi)希爾系數(shù)，PA為分類(lèi)錯(cuò)誤概率聯(lián)合平均相關(guān)系數(shù)，MI為互信息系數(shù)，OS為特征子集選擇，MI+PA+FS為前3種方法聯(lián)合使用，PCA/K-NN為主成分分析聯(lián)合K近鄰算法，LDA/K-NN為線性判別分析聯(lián)合K近鄰算法，NDA/ANN為非線性判別分析聯(lián)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

紋理特征提取和分類(lèi)中，NDA/ANN法可以獲得較低的誤判率，平均誤判率為3.95%，PCA/K-NN法誤判率最高，平均17.7%，LDA/K-NN法居兩者之間，平均11.3%（圖2C）。本研究中得出區(qū)分大鼠高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤的最低誤判率為0（0/64），在T2WI圖像上通過(guò)PA聯(lián)合NDA/ANN所得，出現(xiàn)1次（表2）。

表2 不同MRI序列上5種方法對(duì)64個(gè)高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤的誤判情況[例(%)]

在最佳分類(lèi)序列T2WI中所篩選出的3類(lèi)（共生矩陣、游程矩陣、直方圖）特征參數(shù)中，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共有10個(gè)紋理參數(shù)在高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），包括直方圖第10、50、90、99百分位數(shù)（percentile，Perc）、平均值（histogram's mean，Mean）、總熵值（sum entropy，SumEntrp）、游程圖像分?jǐn)?shù)（fraction of image in runs，F(xiàn)raction）、長(zhǎng)游程因子（long run emphasis，LngREmph）、灰度非均勻度（grey level nonuniformity，GLevNonU）、游程長(zhǎng)非均勻度（run length nonuniformity，RLNonUni）（表3）。將上述紋理參數(shù)納入二元Logistic回歸模型分析，最終篩選出與病理級(jí)別有相關(guān)性（P<0.05）的特征參數(shù)包括RLNonUni和GLevNonU（表4）。對(duì)篩選出的影像組學(xué)特征進(jìn)行ROC曲線分析，以ROC曲線下面積（AUC）為判斷模型擬合效果，其中以RLNonUni診斷效能相對(duì)最佳，AUC為 0.839±0.049（P<0.01），截?cái)嘀禐?245.44，對(duì)應(yīng)的敏感度為0.824，特異度為0.733（圖3）。

圖3 T2WI提取的游程長(zhǎng)非均勻度（RLNonUni）和灰度非均勻度（GLevNonU）鑒別高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤的ROC曲線

表3 T2WI圖像3類(lèi)特征參數(shù)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果

表4 T2WI最佳紋理特征Logistics回歸分析結(jié)果

3 討論

3.1 膠質(zhì)瘤的影像特征 顱內(nèi)膠質(zhì)瘤影像表現(xiàn)多樣，不同級(jí)別、分子亞型膠質(zhì)瘤MRI信號(hào)存在重疊[8]，并且膠質(zhì)瘤內(nèi)部不同區(qū)域隨著疾病的發(fā)展，可出現(xiàn)不同分子亞型的腫瘤細(xì)胞，即腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性[9-10]，上述因素導(dǎo)致膠質(zhì)瘤MRI術(shù)前分級(jí)、分型存在較大的困難[11]。

3.2 紋理分析技術(shù)在膠質(zhì)瘤診療中的價(jià)值 紋理分析技術(shù)通過(guò)基于計(jì)算機(jī)運(yùn)算反映數(shù)字圖像中像素灰度分布特征，可高通量地提取 MRI圖像的大量紋理特征[12]，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)、建立模型，可提供腫瘤診斷、分級(jí)、預(yù)后評(píng)估等信息，可能有助于揭示腫瘤的異質(zhì)性[13]。Yu等[14]研究腦膠質(zhì)瘤MRI圖像特征與異檸檬酸脫氫酶（IDH1）基因突變的關(guān)系，通過(guò)提取、篩選圖像紋理特征并建立預(yù)測(cè)模型，獲得80%的分類(lèi)準(zhǔn)確率。吳亞平等[15]利用互信息和Logistic回歸模型對(duì)腦膠質(zhì)瘤T2WI數(shù)據(jù)分析，獲得19個(gè)紋理特征，模型預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤分級(jí)準(zhǔn)確率為90.7%。

3.3 MRI紋理分析最佳圖像序列的選擇 本研究分析了多個(gè) MRI序列圖像的紋理特征，從中篩選出的最佳分類(lèi)序列為T(mén)2WI主要是由于T2WI有較高的動(dòng)態(tài)范圍，即最低信號(hào)為0，最高信號(hào)由腦脊液決定，這可以使某些紋理特征計(jì)算更加準(zhǔn)確可靠[16]。增強(qiáng)T1WI可以反映腫瘤的血供特點(diǎn)，也有學(xué)者直接提取該序列圖像的紋理特征進(jìn)行膠質(zhì)瘤分級(jí)、鑒別的研究[17-19]。本研究中增強(qiáng)T1WI提供的有價(jià)值紋理特征較T2WI少，可能是由于增強(qiáng)T1WI動(dòng)態(tài)范圍小所致。同時(shí)，增強(qiáng)T1WI上腫瘤壞死、囊變、強(qiáng)化區(qū)域過(guò)小，可能無(wú)法提供高辨識(shí)度的紋理特征[7]。

3.4 適用于大鼠膠質(zhì)瘤模型分級(jí)診斷的最佳MRI紋理特征 游程矩陣是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法的紋理特征，該特征適合于描述具有隨機(jī)性、非均勻性結(jié)構(gòu)的醫(yī)學(xué)圖像[6]。Kunimatsu等[18]回顧性分析了 44例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者和16例原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤患者，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤MRI圖像RLNonUni明顯升高。Li等[20]通過(guò)對(duì)乳腺良惡性腫瘤鉬靶圖像的紋理分析，發(fā)現(xiàn)游程矩陣的紋理特征在兩者之間存在顯著差異。游程矩陣特征參數(shù)反映了具有某灰度值的像素于既定方向上連續(xù)出現(xiàn)的頻數(shù)，可以間接反映圖像的粗糙程度[21]。RLNonUni可描述圖像中游程長(zhǎng)度的相似性，該數(shù)值越小，提示圖像上游程長(zhǎng)度相似；反之，提示圖像上游程長(zhǎng)度不一，即圖像紋理粗糙且粗細(xì)不均勻[22]。在本研究中通過(guò) Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，RLNonUni在區(qū)分高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤方面較其他紋理特征更有價(jià)值。與低級(jí)別膠質(zhì)瘤組相比，高級(jí)別膠質(zhì)瘤組RLNonUni數(shù)值增大，表明圖像紋理粗細(xì)不均勻，與高級(jí)別膠質(zhì)瘤腦組織受損更嚴(yán)重，在宏觀圖像上信號(hào)不均，易出現(xiàn)出血、壞死、囊變一致。該特征參數(shù)在常規(guī)T2WI序列上的診斷效能中等（AUC=0.839），可能是由于膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性特點(diǎn)，不同級(jí)別腫瘤在微觀結(jié)構(gòu)上本身有一定的重疊，故單純依靠形態(tài)的常規(guī)MRI紋理分析結(jié)果存在一定的誤判率，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合擴(kuò)散加權(quán)成像、灌注加權(quán)成像等功能MR圖像的紋理分析，可以提高膠質(zhì)瘤的分級(jí)診斷效能。

3.5 本研究的局限性 ①僅分析了 MR常規(guī)序列，未分析功能序列；②部分病灶較小，可能存在部分容積效應(yīng)；③未對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行病例驗(yàn)證，以上不足將在進(jìn)一步研究中完善。

總之，對(duì)于大鼠 C6膠質(zhì)瘤模型，常規(guī) MR中T2WI的紋理特征可用于鑒別高、低級(jí)別腫瘤，其中游程長(zhǎng)非均勻度參數(shù)鑒別診斷效能相對(duì)最高，可為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤治療、預(yù)后提供客觀依據(jù)。