常小妮，沈亞梅，商靜，邱英武，阮驪韜*

1.陜西省人民醫(yī)院超聲診斷中心，西安 710068；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲科，西安 710061；

心腦血管疾病是威脅人類生命健康的主要因素，其病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[1]。建立合適的動(dòng)物模型模擬人類AS病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，是研究AS病因、病理機(jī)制及探討其治療措施的必要平臺(tái)。本研究采用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)大白兔的方法，建立AS動(dòng)物模型。超聲造影（CEUS）能夠通過(guò)顯示AS斑塊內(nèi)新生血管的分布情況用于評(píng)估斑塊的穩(wěn)定性[2]，CEUS定量分析方法較半定量分級(jí)方法對(duì)造影后斑塊增強(qiáng)程度的評(píng)估客觀、精確。然而，目前對(duì)動(dòng)物模型AS內(nèi)新生血管的影像研究較少，利用CEUS能否準(zhǔn)確評(píng)估兔AS斑塊內(nèi)新生血管的變化尚無(wú)明確結(jié)論。本研究擬通過(guò)對(duì)AS模型兔行CEUS，采用定量分析的方法評(píng)價(jià)AS病變的血流灌注參數(shù)，分析AS發(fā)展過(guò)程中各個(gè)階段及不同類型病變的新生血管情況。

1 材料與方法

1.1 建立 AS模型 選取雄性大白兔 22只，體重（2.45±0.22）kg。由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（陜）2008-008]。每日高脂高膽固醇飼料100 g/只（0.5%膽固醇、3%玉米油）。定期超聲觀測(cè)兔腹主動(dòng)脈，發(fā)現(xiàn)內(nèi)中膜增厚、斑塊形成時(shí)行CEUS。

1.2 體重及血脂水平檢測(cè) 分別于建模前、20周末、40周末稱重，并于空腹?fàn)顟B(tài)下經(jīng)耳中動(dòng)脈采血3 ml，檢測(cè)三酰甘油（triglycerid，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）。采用氧化酶法測(cè)定TG、TC，采用直接法測(cè)定LDL-C、HDL-C。

1.3 儀器 采用GE Logiq 9超聲診斷儀，ML6-15探頭，采用低機(jī)械指數(shù)反向編碼造影成像技術(shù)（coded phased inversion，CPI）。

1.4 常規(guī)超聲檢查 分別于建模前、20周末和40周末觀察兔動(dòng)脈管壁內(nèi)中膜厚度（intima-media thickness，IMT）的變化、AS斑塊形成情況，記錄并采集病變處數(shù)據(jù)及圖像。在長(zhǎng)軸切面測(cè)量 IMT及斑塊厚度，多個(gè)斑塊時(shí)選取厚度最厚的斑塊。

1.5 CEUS檢查 啟用CPI的小器官造影模式，機(jī)械指數(shù) 0.13，聚焦于腹主動(dòng)脈水平，靜脈團(tuán)注對(duì)比劑SonoVue（意大利Braccoon公司）1.5 ml。實(shí)時(shí)觀察管腔及選定部位的顯影情況2 min，并儲(chǔ)存全過(guò)程動(dòng)態(tài)圖像。

1.6 圖像分析及定量計(jì)算 啟動(dòng)聲學(xué)密度定量分析的時(shí)間-強(qiáng)度曲線分析軟件對(duì)感興趣區(qū)（ROI）進(jìn)行動(dòng)態(tài)量化分析，觀察對(duì)比劑微泡回聲的量隨時(shí)間的變化，獲取ROI的CEUS增強(qiáng)相關(guān)參數(shù)。ROI大小為1 mm×1 mm ，將其手動(dòng)放置于需檢測(cè)部位，儀器擬合時(shí)間-強(qiáng)度曲線，軟件自動(dòng)計(jì)算并顯示超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線下面積（AUC）等相應(yīng)測(cè)量參數(shù)。為了盡量減少人為誤差，同一實(shí)驗(yàn)兔選擇不同ROI重復(fù)測(cè)取3次，取平均值，以期獲取盡可能準(zhǔn)確的分析數(shù)據(jù)。AUC可較好地反映一定時(shí)間內(nèi)局部組織造影增強(qiáng)的累積效應(yīng)，與局部血流量呈線性正相關(guān)，若分布容積、劑量、增益條件控制恒定不變，AUC與實(shí)際流速及平均渡越時(shí)間成反比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件，采用W檢驗(yàn)法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，多組間體重、血脂指標(biāo)、定量分析AUC值比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

按照造模過(guò)程的先后將實(shí)驗(yàn)兔分為 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，即建模前、20周末和40周末。由于造模周期較長(zhǎng)，喂養(yǎng)過(guò)程中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別存活22只、20只和17只。

2.1 體重的變化 隨建模時(shí)間延長(zhǎng)體重逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。建模前與20周末和40周末比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）；20周末與40周末比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2 血脂水平的變化 TG、TC、LDL-C值均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)，其中TG、LDL-C升高最為明顯，HDL-C值隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸降低趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01），不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）（表1）。

2.3 常規(guī)超聲檢查 建模前實(shí)驗(yàn)兔腹主動(dòng)脈管壁光滑，內(nèi)膜不易顯示，內(nèi)壁無(wú)增厚、隆起、斑塊形成；20周末時(shí)，20只實(shí)驗(yàn)兔中，18只腹主動(dòng)脈管壁局限性增厚（>1 mm），但無(wú)明顯斑塊形成；40周末時(shí)，17只實(shí)驗(yàn)兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙增厚，其中15只合并強(qiáng)回聲粟粒樣斑塊形成。22只實(shí)驗(yàn)兔中，18只（81%）發(fā)生內(nèi)中膜增厚，15只（68%）形成明顯 AS斑塊（圖1）。

表1 不同時(shí)期實(shí)驗(yàn)兔體重及血脂水平比較（ ±s）

表1 不同時(shí)期實(shí)驗(yàn)兔體重及血脂水平比較（ ±s）

注：與建模前比較，*P<0.01；與20周末比較，#P<0.01

時(shí)間體重（k g）T C（m m o l/L）T G（m m o l/L）L D L-C（m m o l/L）H D L-C（m m o l/L）建模前（n=2 2）2.3 2±0.2 6 1.4 1±0.5 4#1.4 7±1.6 8#0.7 6±0.3 8#6.0 5±0.7 1#2 0周末（n=2 0）3.3 2±0.1 6*3 1.1 2±0.4 5*2.8 6±1.4 3*2 2.3 1±3.5 4*4.5 6±0.4 9*4 0周末（n=1 7）3.4 5±0.1 1*3 4.6 4±1.0 5*#5.8 8±1.1 4*#2 5.4 9±0.7 6*#0.5 0±1.6 9*#F值8 9.4 0 1 2 5.6 4 6 5.3 2 1 9 8.6 2 1 0 2.3 6 P值<0.0 1<0.0 1<0.0 1<0.0 1<0.0 1

圖1 常規(guī)超聲檢查。建模前兔腹主動(dòng)脈管壁光滑，內(nèi)膜顯示不清（A）；高脂飼料喂養(yǎng)20周末，內(nèi)中膜局限性增厚（B）；40周末管壁可見明顯斑塊形成（C）

2.4 CEUS定量分析 團(tuán)注對(duì)比劑后，實(shí)驗(yàn)兔腹主動(dòng)脈時(shí)間-強(qiáng)度曲線大多呈單峰型，為陡直上升的增強(qiáng)期，和其后緩慢下降的清除期。建模前、20周末和40周末兔腹主動(dòng)脈的 AUC 值分別為（516.63±23.74）%·s、（969.11±46.26）%·s和（1090.59±79.14）%·s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；建模后20周末和40周末均高于建模前（P<0.01）；20周時(shí)與40周時(shí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

圖2 模型兔在不同時(shí)間點(diǎn)AUC值比較。與建模前比較，△P<0.01；與20周末比較，▲P>0.05；與建模前比較，※P<0.01

3 討論

建立動(dòng)物模型研究AS病變的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)防治療，在目前的實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用廣泛。本研究中經(jīng)長(zhǎng)期高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)兔，常規(guī)超聲及CEUS定期觀察，隨著時(shí)間延長(zhǎng)兔腹主動(dòng)脈逐漸發(fā)生變化。首先，引起動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙、IMT增厚。王家祥等[3]利用常規(guī)超聲觀察兔AS病變的研究結(jié)果顯示，正常兔主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)顯示為“雙線征”，即兩條平行強(qiáng)回聲線、中間為線狀低回聲帶。但本研究顯示常規(guī)超聲不易清楚地顯示正常兔腹主動(dòng)脈壁內(nèi)、中、外膜3層結(jié)構(gòu)，尤其是內(nèi)-中膜常規(guī)超聲很難顯示清楚，與徐麗榮[4]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，該實(shí)驗(yàn)也觀察到常規(guī)超聲無(wú)法區(qū)別動(dòng)脈的內(nèi)膜、中層及外膜，內(nèi)膜顯示不佳，其原因可能是由于兔動(dòng)脈管壁薄，超聲圖像上呈現(xiàn)低回聲的中膜層比較薄，故不易顯示出動(dòng)脈的內(nèi)膜。隨著高脂飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)脈AS病變逐漸發(fā)展，模型免腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的回聲較正常增強(qiáng)，常規(guī)超聲也可清楚地顯示內(nèi)膜變粗糙、增厚直至粥樣斑塊形成，與徐麗榮[4]的研究結(jié)果一致。故超聲檢查可以較敏感地顯示實(shí)驗(yàn)兔AS模型建立過(guò)程中動(dòng)脈管壁的形態(tài)學(xué)變化，能夠觀察AS病變發(fā)展過(guò)程中不同階段的表現(xiàn)。

單純高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)法建立兔AS模型的優(yōu)點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)對(duì)象易獲得，操作簡(jiǎn)便、易行，且對(duì)動(dòng)物損傷小，造模成功率高；此法符合AS形成機(jī)制的脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)，較好地模擬了人類AS病變的形成過(guò)程。其缺點(diǎn)是：造模周期長(zhǎng)，因動(dòng)物個(gè)體差異的影響產(chǎn)生AS病變的時(shí)間不容易得到控制；所建立的AS模型其斑塊性質(zhì)不可控，尤其是建立破裂、出血等復(fù)雜性斑塊更為困難。本研究所建立的AS兔模型，其斑塊多為粟粒樣強(qiáng)回聲斑塊。建模過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)兔體重及血脂水平在不同時(shí)期的變化表明，體重及血脂水平與AS病變的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

隨著對(duì)AS病變的發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)制及其引發(fā)心腦血管疾病原因的深入認(rèn)識(shí)，評(píng)價(jià)AS斑塊內(nèi)的穩(wěn)定性具有重要的臨床意義。近年來(lái)，新型超聲對(duì)比劑的應(yīng)用和發(fā)展使得 CEUS可顯示組織內(nèi)微小血管的灌注情況，臨床上已利用這一簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)的技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)斑塊內(nèi)的新生血管評(píng)估斑塊的穩(wěn)定性。用半定量的造影增強(qiáng)程度人為分級(jí)的方法，根據(jù)造影過(guò)程中斑塊顯影程度的不同可以反映斑塊內(nèi)新生血管的增生程度。Sun等[5]研究顯示，應(yīng)用CEUS增強(qiáng)程度人為分級(jí)的方法評(píng)價(jià)斑塊內(nèi)新生血管形成和斑塊免疫組化微血管密度的檢測(cè)結(jié)果具有相關(guān)性。但肉眼觀察的方法主觀性強(qiáng)，CEUS定量分析能對(duì)斑塊的增強(qiáng)程度提供更加客觀、量化的指標(biāo)。定量分析較半定量分析可更客觀地反映斑塊造影增強(qiáng)情況[6]。

本研究中，模型兔腹主動(dòng)脈在未形成明顯斑塊但已發(fā)生管壁增厚時(shí)，其內(nèi)中膜AUC值較基礎(chǔ)狀態(tài)明顯增高，提示AS早期尚未形成斑塊時(shí)，病變局部增厚的內(nèi)中膜內(nèi)即已有明顯的新生血管增生，并可通過(guò)CEUS敏感地檢測(cè)到，與Magnoni等[7]的研究結(jié)果相符，該研究對(duì)25例有頸動(dòng)脈斑塊者與15例頸動(dòng)脈正常者行 CEUS檢查，分析其頸動(dòng)脈外膜滋養(yǎng)血管（vasa vasorum，VV）造影增強(qiáng)的程度，并與自身 IMT相對(duì)照，結(jié)果表明有斑塊組的VV明顯高于正常組，而且與IMT相關(guān)。IMT是評(píng)價(jià)AS早期改變的重要指標(biāo)，也是預(yù)測(cè)患者發(fā)生心腦血管意外危險(xiǎn)性的有力指標(biāo)[8-9]。既往研究顯示，IMT與CEUS斑塊增強(qiáng)程度之間無(wú)相關(guān)性[10-11]，提示IMT與新生血管增生程度之間不相關(guān)。結(jié)合分析既往研究與本研究，AS病變?cè)缙跍y(cè)量IMT與檢測(cè)內(nèi)-中膜新生血管情況是兩個(gè)獨(dú)立的評(píng)估指標(biāo)，可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以結(jié)合起來(lái)評(píng)估AS早期病變的危險(xiǎn)性。

本研究中，兔腹主動(dòng)脈形成明顯斑塊后，其CEUS定量分析AUC較內(nèi)中膜增厚時(shí)略有增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其可能原因?yàn)椋罕狙芯恐心Ｐ屯盟纬傻陌邏K多為強(qiáng)回聲斑塊，斑塊內(nèi)新生血管較少，故與增厚內(nèi)膜內(nèi)的新生血管數(shù)量相比并無(wú)明顯差異，而且本研究樣本量偏小，有待今后增加樣本量深入研究。