柴亞男 ，郝娟 ，馬雪蓮 ，2，閆翠環(huán) ，王香婷 ，2，許慶友 ，2

1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 石家莊 050091 2.河北省肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 050091

梗阻性腎病是指因尿流障礙導(dǎo)致腎臟實質(zhì)性損害的疾病，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin aldosterone system，RAAS)在其發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，尤其是醛固酮，可以激活鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptor，MR)，誘導(dǎo)細胞增殖、表型轉(zhuǎn)化、凋亡、炎性壞死以及自噬等，進而發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化。細胞增殖等已有較多的研究，而細胞自噬在其中的作用尚需深入觀察。細胞自噬是真核細胞在溶酶體的介導(dǎo)下降解受損的細胞器和異常大分子蛋白，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及形態(tài)功能完好的過程。Kim WY等[1]在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral ureteral obstruction，UUO)所致梗阻性腎病的早期階段檢測到了自噬的發(fā)生，并證實其早于細胞凋亡和腎小管纖維化。本實驗采用UUO建立梗阻性腎病的大鼠模型，誘導(dǎo)MR活化，給予益氣活血解毒中藥治療，并采用血管緊張素II(Angiotensin II，AngII)受體拮抗劑纈沙坦作為陽性對照，通過檢測自噬蛋白及相關(guān)通路的表達，探討益氣活血解毒中藥對梗阻性腎病中細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選用清潔級雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(180±20)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1003，隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組)、纈沙坦組(Val組)和中藥組(TCM組)，每組12只。

1.2 實驗藥物 纈沙坦購自諾華公司；益氣活血解毒中藥選用廣東一方制藥公司免煎顆粒(黃芪15 g，僵蠶、地龍、蟬蛻、烏蛇、丹參、鱉甲、赤芍、金銀花、野菊花、蒲公英、當(dāng)歸各10 g，大黃6 g)，按比例混勻煎煮15 min，水煎液含生藥4 kg/L，參照徐叔云《藥理實驗方法學(xué)》折合大鼠用量為14 g/(kg·d)給藥。

1.3 試劑和儀器 糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶(Serum and glucocorticoid induced kinase，SGK-1)抗體選用Affbiotech產(chǎn)品，磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase，P-ERK)和 GAPDH抗體選用Bioworld Technology產(chǎn)品，mTOR、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated target of rapamycin，P-mTOR)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubular-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體選用Cell Signaling Technology產(chǎn)品，自噬相關(guān)基因5(Autophagy associated gene 5，Atg5)和 Beclin-1抗體選用Proteintech產(chǎn)品，免疫組化試劑盒選用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。電泳儀及電泳槽(北京六一公司)，OLYMPUS VANOX PM-10AD型顯微照相儀(OLYMPUS公司)，LEICARM 2245型石蠟切片機(LEICA上海分公司)，ODY-3059掃描儀(Li-cor公司)。

1.4 模型制備及給藥方法 實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，通過UUO建立梗阻性腎病的動物模型，用10%的水合氯醛以3 mL/kg的劑量通過腹腔注射麻醉動物，Sham組于左側(cè)中腹部切開皮膚，僅將輸尿管游離但不結(jié)扎不切斷，逐層縫合皮膚；UUO組于左側(cè)中腹部切開皮膚，游離左側(cè)輸尿管，分別在輸尿管上1/3及下1/3處用絲線結(jié)扎后切斷輸尿管，逐層縫合皮膚；Val組和TCM組造模同UUO組。各組分別于造模前1天開始給藥，造模當(dāng)天不給藥，纈沙坦組給予纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃；中藥組給予中藥煎劑14 g/(kg·d)灌胃；UUO組及Sham組均給予與治療組等量的生理鹽水灌胃。10天后處死動物，摘取梗阻側(cè)的腎臟，一部分組織放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片行免疫組化染色；剩余組織-70℃保存，用于Western blot檢測蛋白表達。

1.5 檢測指標及方法 每組選取4只大鼠檢測指標。采用SABC法檢測LC3、Beclin-1、Atg5、P-mTOR的表達，一抗?jié)舛染鶠?∶100。Western blot檢測自噬蛋白、MR的激活及相關(guān)通路的表達。取冰凍腎臟組織100 mg加裂解液(含蛋白酶抑制劑)0.4 mL，提取蛋白并測定含量，配制相應(yīng)濃度的濃縮膠和分離膠，加入上樣蛋白適量，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗 Atg5、Beclin-1、LC3II/I、SGK-1、P-ERK1/2、P-mTOR抗體(1∶1 000)，4℃過夜，次日TBS清洗3次，加入相應(yīng)二抗(1∶20 000)孵育后TBS清洗3次，顯影，與所得內(nèi)參進行校正后比較。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果滿足正態(tài)性分布，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)值變量以(±s)表示，兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織LC3、Beclin-1、Atg5和P-mTOR表達結(jié)果比較 見圖1。Sham組的LC3、Beclin-1和Atg5呈弱表達，見于腎小管上皮細胞的細胞漿和細胞膜，而UUO組表達明顯增強，主要見于腎小管上皮細胞的細胞膜；與UUO組比較，Val組和TCM組LC3、Beclin-1和Atg5表達均明顯減弱。Sham組P-mTOR呈陽性表達，見于腎小管上皮細胞的細胞核，UUO組表達減弱；與UUO組比較，Val組和TCM組P-mTOR表達增強。

2.2 各組大鼠腎組織Atg5、Beclin-1和LC3II/I表達結(jié)果比較見表 1。與 Sham組比較，UUO組大鼠 Atg5、Beclin-1、LC3II/I表達明顯增強(P＜0.01)；與UUO組比較，Val組和TCM組大鼠Atg5、Beclin-1、LC3II/I表達明顯減弱(P＜0.05，P＜0.01)。

2.3 各組大鼠腎組織SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表達結(jié)果比較 見表2。與Sham組比較，UUO組SGK-1、P-ERK1/2表達明顯增強(P＜0.01)；與UUO組比較，Val組和TCM組SGK-1、P-ERK1/2表達明顯減弱(P＜0.05，P＜0.01)。與Sham組比較，UUO組P-mTOR/mTOR表達減弱(P＜0.01)，與UUO組比較，Val組和TCM組P-mTOR/mTOR表達增強(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠腎組織LC3、Beclin-1、Atg5和P-mTOR表達結(jié)果比較 (×400)

表1 各組大鼠腎組織Atg5、Beclin-1和LC3II/I表達結(jié)果比較(±s) μg/μL

表1 各組大鼠腎組織Atg5、Beclin-1和LC3II/I表達結(jié)果比較(±s) μg/μL

與Sham組比較，①P＜0.01；與UUO組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別S h a m組U U O組V a l組T C M組n 4 4 4 4 A t g 5 0.1 6 5±0.1 0 2 2.2 7 0±0.8 6 4①0.6 9 5±0.2 7 6③0.8 3 2±0.3 3 3③B e c l i n-1 0.1 9 5±0.0 8 6 0.3 6 5±0.0 4 0①0.2 6 0±0.0 9 0②0.2 7 0±0.0 9 2②L C 3 I I/I 1.3 7 5±0.2 6 2 4.7 8 0±1.1 6 7①3.4 3 8±0.2 5 2②3.6 0 8±0.4 5 8②

表2 各組大鼠腎組織SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表達結(jié)果比較(±s) μg/μL

表2 各組大鼠腎組織SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表達結(jié)果比較(±s) μg/μL

與Sham組比較，①P＜0.01；與UUO組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別S h a m組U U O組V a l組T C M組n 4 4 4 4 S G K-1 0.4 8 3±0.5 3 2 1.2 4 0±0.1 9 8①0.8 6 0±0.1 0 5②0.9 9 0±0.1 0 8②P-E R K 1/2 0.4 0 0±0.1 3 7 0.7 9 5±0.9 4 7①0.5 5 3±0.9 2 2③0.5 5 8±0.4 1 9③P-m T O R/m T O R 1.6 1 3±0.2 5 7 0.4 4 5±0.2 5 4①1.4 7 2±0.0 7 9③1.3 7 7±0.2 4 1③

3 討論

UUO模型是研究腎間質(zhì)纖維化的常用模型。有研究證實UUO可以促進醛固酮的分泌，醛固酮不僅可以調(diào)節(jié)鈉離子及水分子的再吸收，還參與了炎癥損傷和氧化應(yīng)激等病理反應(yīng)[2]，在UUO大鼠的腎臟中，富含線粒體和氧化酶的近端小管更容易受損[3]；我們之前通過檢測UUO大鼠的血清及尿液中8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OhdG)含量，也證實了醛固酮很可能通過氧化應(yīng)激加重腎臟損傷[4]。SGK-1是一種絲氨酸轉(zhuǎn)移酶，參與了醛固酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎性損傷和腎臟纖維化等病理過程，是反映醛固酮誘導(dǎo)臟器損傷的重要介質(zhì)[5]。本實驗采用Western blot檢測SGK-1蛋白的表達，結(jié)果顯示與Sham組比較，UUO組SGK-1的表達明顯增強，證實醛固酮通過SGK-1通路誘導(dǎo)腎臟的損傷。

氧化應(yīng)激不僅與醛固酮有密切的聯(lián)系，也是影響自噬發(fā)展的重要因素。Chen Y等[6]提出在葡萄糖或血清等營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)最初產(chǎn)物超氧陰離子自由基(O2-)參與了自噬的發(fā)生，當(dāng)細胞處于饑餓狀態(tài)時，H2O2分子會立即激活延伸進而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。LC3是自噬的標志性蛋白[7]，以LC3I和LC3II 2種形式存在于細胞中，當(dāng)自噬發(fā)生時存在于細胞質(zhì)中的LC3I經(jīng)過泛素修飾過程與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，即轉(zhuǎn)化為分子量較小的LC3II，并聚集形成自噬體膜，所以通常采用Western blot檢測LC3II/I來評價自噬的活性[8]。Beclin-1是自噬基因Atg6/Vps30的同源基因[9]，通過與III型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)結(jié)合形成Beclin1-PI3K復(fù)合物，引導(dǎo)相關(guān)蛋白形成蛋白復(fù)合體，促進自噬體膜的形成[10]。本實驗通過Western blot和免疫組化檢測LC3和Beclin-1的表達證實了在UUO所致的梗阻性腎病中自噬的發(fā)生。

P-ERK1/2通路在營養(yǎng)缺乏或氧化損傷的條件下很容易被激活，有研究表明醛固酮與胞漿內(nèi)受體結(jié)合，可快速誘導(dǎo)P-ERK1/2激酶的磷酸化[11]，通過P-ERK1/2磷酸化將信號從表面受體傳導(dǎo)至細胞核，促進其與自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達。自噬過程主要受自噬相關(guān)基因(Atg)調(diào)控，其中Atg5在促進自噬的發(fā)展和減緩腎臟損傷的過程中起到了重要作用。在自噬體的延伸階段，有Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物于其外膜結(jié)合[12]，該復(fù)合物的形成對自噬過程至關(guān)重要，因為其中任何成分的突變都會導(dǎo)致自噬缺陷[13]；Li HY等[14]用免疫熒光法分別檢測敲除Atg5小鼠與未敲除Atg5小鼠中LC3II的陽性表達發(fā)現(xiàn)，與未敲除Atg5的小鼠相比，敲除Atg5小鼠中的細胞自噬明顯受到抑制，且腎臟纖維化更嚴重。本實驗中UUO組大鼠LC3、Beclin-1和Atg5的表達較Sham組明顯增強，且與SGK-1、P-ERK1/2的表達增強相一致，說明MR活化后通過SGK-1通路和P-ERK1/2通路促進了梗阻性腎病中自噬的發(fā)生。

P-ERK1/2下游的P-mTOR通路也是調(diào)控自噬的1條重要通路，P-mTOR是1種存在于哺乳動物中的非典型的絲氨酸激酶，是自噬的負調(diào)控分子。梗阻性腎病早期生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)機制反應(yīng)可以抑制P-mTOR的表達，激活細胞自噬，從而清除細胞內(nèi)因輸尿管梗阻產(chǎn)生的異常蛋白分子和過氧化物等物質(zhì)[13]。本實驗結(jié)果表明在UUO術(shù)后早期P-mTOR通路被抑制，自噬表達增強，當(dāng)給予纈沙坦和益氣活血解毒中藥治療后P-mTOR表達增強，自噬受到抑制。

RAAS激活后，AngII在膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯酮環(huán)節(jié)發(fā)揮了重要作用，從而促進醛固酮的合成。纈沙坦是AngII受體拮抗劑，可以通過抑制AngII的作用阻斷醛固酮的合成，所以選用纈沙坦作為陽性對照藥物。

梗阻性腎病發(fā)病與中醫(yī)學(xué)中的腎著、癃閉等疾病相似，其病因以脾腎虧虛為本，氣血瘀滯，痰濕阻塞尿道為標，總屬“虛、瘀、毒”范疇。氣虛則衛(wèi)外不固，邪氣侵襲臟腑而發(fā)病；脾腎虧虛則氣血津液運化失常，痰濁、水濕聚而成“瘀”；氣血運行不暢，濁邪壅阻于內(nèi)，日久成“毒”，治療當(dāng)“益氣、活血、解毒”。方中黃芪益氣扶正；丹參、赤芍活血散瘀；地龍、烏梢蛇、僵蠶、醋鱉甲通絡(luò)散結(jié)；大黃、黃芩、金銀花、蒲公英清熱解毒。前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血解毒中藥可下調(diào)炎性因子表達，減輕炎癥損傷，減緩梗阻性腎病的進展[15]。本實驗結(jié)果表明給予中藥治療后，UUO大鼠腎臟內(nèi)醛固酮的活性降低，自噬的表達明顯受到了抑制。

本實驗觀察益氣活血解毒中藥對梗阻性腎病中細胞自噬的影響，結(jié)果顯示UUO組細胞自噬的表達與MR的活化程度均明顯高于Sham組，而Val組和TCM組均受到抑制?？梢娨鏆饣钛舛局兴幙梢酝ㄟ^調(diào)控SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR通路抑制MR的活化，減緩梗阻性腎病中細胞自噬的發(fā)生，從而減輕腎臟損傷。