陳晨，王利玲

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，浙江 杭州 310000

新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxia ischemic brain damage，HIBD)是導(dǎo)致新生兒死亡及小兒致殘的主要疾病之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對HIBD的治療無特效治療方案，多采用亞低溫[1]及對癥支持治療。目前已有研究表明丹參酮IIA(Tanshinone IIA，TSA)對改善HIBD有顯著療效[2]，而細(xì)胞缺氧時，低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-Inducible Factor-1α，HIF-1α)基因的表達(dá)會增加，對恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。本文將通過研究驗(yàn)證新生大鼠HIBD時，TSA在改善腦代謝作用上與HIF-1α基因表達(dá)存在的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)所用新生大鼠為親代大鼠交配生產(chǎn)所得的7日齡健康SD大鼠(親代SD大鼠購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，共60只，體質(zhì)量為(14±2)g，雌雄不限，動物合格證號：SYXK(浙)2008-0015。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心清潔級玻璃艙內(nèi)，飼養(yǎng)溫度18～22℃，濕度為45%～65%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 丹參酮IIA磺酸鈉(商品名：諾新康)，購自上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號為120116，規(guī)格為2mL/10mg。

1.3 主要試劑 RT-PCR主要試劑：總RNA提取試劑(D9108B)、定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR 037A)、熒光定量PCR試劑盒(DRR 420A)均由杭州皓豐生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；HIF-1α及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上下游引物由TAKARA公司設(shè)計、合成及生產(chǎn)。免疫組化主要試劑：SD大鼠HIF-1α抗體由浙江俊豪生物有限公司生產(chǎn)；兔二抗試劑由浙江俊豪生物有限公司生產(chǎn)。

1.4 動物分組及模型制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠隨機(jī)分5組：假手術(shù)組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組，每組各12只。圍產(chǎn)期HIBD大鼠模型制備依據(jù)Rice JE等[3]的方法造模。先經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)；用滅菌絲線結(jié)扎左頸總動脈，復(fù)位皮下組織，縫合切口；術(shù)后送回母鼠身邊休息2 h。其中假手術(shù)組麻醉后游離左頸總動脈而不結(jié)扎，復(fù)位皮下組織，縫合切口。治療組造模后，以丹參酮IIA磺酸鈉腹腔注射。

1.5 給藥方法 假手術(shù)組、模型組分別予3.2 mL/100 g 5%葡萄糖(TSA注射液溶劑)腹腔注射；高、中、低劑量治療組TSA給藥劑量依次為3.2 mL/100 g(160 mg/kg)、1.6 mL/100 g(80 mg/kg)、0.8 mL/100 g(40 mg/kg)，另外分別予 0 mL/100 g、1.6 mL/100 g及2.4 mL/100 g 5%葡萄糖平衡液體總量。術(shù)后休息3 h后開始注射，早晚各1次，連續(xù)3天。

1.6 各組大鼠行為觀察 觀察各組大鼠造模前后及治療后神經(jīng)系統(tǒng)(煩躁、嗜睡或精神抑制)、呼吸系統(tǒng)(呼吸快慢)、運(yùn)動系統(tǒng)(刻板運(yùn)動，不自主顫動，抽搐等)的行為改變。

1.7 各組大鼠各指標(biāo)檢測方法 取出各組大鼠左側(cè)腦組織，分2份，1份放入凍存管內(nèi)，置于液氮冷藏，移至-80℃冰箱內(nèi)備用；另1份置于10%福爾馬林溶液內(nèi)，室溫固定24 h。用熒光定量PCR方法檢測各組HIF-1α的表達(dá)，采用HE染色方法觀察腦組織病理變化，HIF-1α原位免疫組織化學(xué)標(biāo)記染色，顯微鏡下進(jìn)行陽性表達(dá)對比。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所得到的計量資料以(±s)來表示。若各組間方差齊，則采用單因素方差分析，兩兩比較用Tukey HSD檢驗(yàn)；若各組間方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)Tamhane's T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)觀察結(jié)果 假手術(shù)組術(shù)后無明顯行為改變。模型組及治療組在造模后7～18 min，表現(xiàn)出躁動不安、呼吸深快、肢體顫抖等；造模后19～60 min，表現(xiàn)出對刺激反應(yīng)減弱、呼吸淺快、四肢活動減少、肌張力下降等；造模后1～3天，上述行為改變開始逐漸恢復(fù)。腹腔注射后觀察3天，治療組比模型組的行為表現(xiàn)恢復(fù)快，且TSA劑量越高，恢復(fù)越好。

2.2 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果比較 見圖1。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)及皮層神經(jīng)細(xì)胞胞核大，胞漿少，無水腫，細(xì)胞排列有序，細(xì)胞間隙緊密，未見細(xì)胞缺失；模型組則神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)水腫，呈氣球樣變，胞核固縮，呈圓形，部分細(xì)胞核碎裂、溶解、消失，細(xì)胞碎片較多，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙明顯增大，缺失明顯，失去正常組織結(jié)構(gòu)。與模型組比較，低劑量治療組神經(jīng)細(xì)胞腫脹稍減輕，細(xì)胞變形不明顯，部分細(xì)胞核碎裂、溶解、消失，細(xì)胞碎片散在分布于細(xì)胞間質(zhì)，有膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列紊亂，稍規(guī)則，細(xì)胞間隙增大，正常組織結(jié)構(gòu)被破壞；中劑量治療組神經(jīng)細(xì)胞水腫減輕，核小而圓，胞漿大而空，部分細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞死亡數(shù)目較少，部分核溶解、消失，細(xì)胞間隙的細(xì)胞碎片較少，細(xì)胞排列紊亂，較規(guī)則，細(xì)胞間隙大，可見細(xì)胞缺失；高劑量治療組神經(jīng)細(xì)胞水腫以輕度為主，細(xì)胞氣球樣變不明顯，細(xì)胞排列明顯較規(guī)則，間隙輕度增大，細(xì)胞缺失不明顯。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果比較 (×200)

2.3 各組大鼠腦組織HIF-1α表達(dá)結(jié)果比較 見圖2。假手術(shù)組大鼠腦組織中HIF-1α僅少量表達(dá)，偶可見棕黃色HIF-1α陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中HIF-1α陽性細(xì)胞明顯減少，散在分布于視野中。與模型組比較，低劑量治療組大鼠腦組織中HIF-1α陽性細(xì)胞較密集，分布較均勻；與低劑量組比較，中劑量治療組大鼠腦組織中HIF-1α陽性細(xì)胞分布更密集，更均勻；高劑量治療組HIF-1α表達(dá)明顯增多，HIF-1α陽性細(xì)胞大量密集均勻分布于腦組織中，海馬、皮質(zhì)均可見陽性細(xì)胞。

圖2 各組大鼠腦組織HIF-1α表達(dá)結(jié)果比較 (×200)

2.4 各組大鼠腦組織HIF-1α基因表達(dá)結(jié)果比較 見表1。假手術(shù)組HIF-1α基因僅少數(shù)表達(dá)，與假手術(shù)組比較，模型組表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量治療組基因表達(dá)增加，且呈一定的劑量依賴性(P＜0.05)。

表1 各組大鼠腦組織HIF-1α基因相對表達(dá)結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠腦組織HIF-1α基因相對表達(dá)結(jié)果比較(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05；與中劑量組比較，④P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量治療組中劑量治療組高劑量治療組n 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 H I F-1 α基因相對表達(dá)量(R Q值)0.1 2 1±0.0 4 0 0.7 0 0±0.2 2 5①1.0 0 6±0.1 3 7②④1.3 7 8±0.2 3 5②③1.6 8 0±0.1 6 3②③④

3 討論

HIBD的發(fā)病與多種因素有關(guān)，妊娠和分娩都可以導(dǎo)致該病的發(fā)生[4]。從缺氧缺血開始到腦細(xì)胞損傷經(jīng)歷了2個階段[5]，第一個階段為代償階段，此時并不發(fā)生腦細(xì)胞的損傷，而是通過增加糖酵解、增加血紅蛋白含量和減少細(xì)胞氧消耗等途徑來增加腦細(xì)胞對氧的利用能力，增強(qiáng)腦細(xì)胞對缺氧的耐受能力。第二階段為損傷階段，如果缺氧缺血持續(xù)存在，則會超過腦細(xì)胞的代償范圍，而發(fā)生缺氧缺血性損傷。缺氧缺血主要對腦細(xì)胞的線粒體、膜結(jié)構(gòu)和溶酶體造成損傷，具體機(jī)制與氧自由基的大量產(chǎn)生、鈣鹽的沉積、細(xì)胞膜2側(cè)離子濃度的紊亂和磷脂酶的活化有關(guān)。通過以上機(jī)制，線粒體的功能受到影響、膜結(jié)構(gòu)被破壞、通透性改變、溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶外溢，造成細(xì)胞的損傷，甚至死亡。因此，若能阻斷以上途徑，便可減少腦細(xì)胞損傷的發(fā)生，增強(qiáng)細(xì)胞對缺氧的耐受性。

HIBD在中醫(yī)兒科學(xué)無相應(yīng)的病名，根據(jù)癥狀表現(xiàn)不同，可以歸入嘔吐、驚風(fēng)等范疇，可參考中風(fēng)對其進(jìn)行辨證。中醫(yī)辨證上總屬為本虛標(biāo)實(shí)，急性期以血瘀為主，氣虛為次，緩解期以本虛氣虛為主，血瘀為其次。而在治療上，多采用具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)通絡(luò)等功效的藥物，使用最多的藥物之一是丹參?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載：“丹參，味苦微寒無毒，主治心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣”，由此可見，中藥丹參具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩及安神的功效。藥學(xué)研究表明丹參中最主要的脂溶性成分是TSA，含量約為0.1%～0.9%[6]，隨著對丹參及其有效成分的深入研究，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥丹參在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著越來越大的作用，而TSA作為丹參中重要的脂溶成分，也發(fā)揮了重要的作用。研究表明，TSA可抑制鈣轉(zhuǎn)運(yùn)和減少細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度[7]，可抑制人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶活化，保護(hù)丙酮醛誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[8]，還能減少血小板的聚集，阻斷再灌注過程中微血栓的形成，改善血液供應(yīng)，防止繼發(fā)性再灌注損傷的發(fā)生[9]。

低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-Inducible Factor-1，HIF-1)是一種隨著細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，為真核生物轉(zhuǎn)錄因子螺旋環(huán)螺旋-PAS蛋白家族成員，由2個亞基組成，α亞基和β亞基，α亞基為主要的活性單位，氧對HIF-1的活性調(diào)節(jié)主要通過該亞基完成。HIF-1是低氧耐受時相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中心，在恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起到主要作用。正常情況下各組織HIF-1α表達(dá)很少，而低氧可以增加其穩(wěn)定性和活性，其表達(dá)呈時序性和低氧濃度依賴性[10～12]。

本研究以新生大鼠為模型，通過研究TSA干預(yù)HIBD，發(fā)現(xiàn)TSA能顯著改善腦細(xì)胞水腫、變性，減少細(xì)胞核碎裂，減少組織細(xì)胞缺失，減少炎癥細(xì)胞浸潤，明顯改善組織細(xì)胞的缺氧缺血性病變，并且其改善效果與TSA的劑量呈正相關(guān)。關(guān)于TSA與腦細(xì)胞中HIF-1表達(dá)量的關(guān)系目前研究較少，筆者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)TSA能通過上調(diào)HIF-1α基因的表達(dá)、促進(jìn)下游基因表達(dá)來改善HIBD，發(fā)揮對新生大鼠腦組織損傷保護(hù)的作用，證實(shí)了TSA治療HIBD的分子機(jī)制，為臨床上TSA防治HIBD提供了有力的理論依據(jù)。