， ，

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)中心， 上海 200234)

水稻胚乳主要貯藏物質(zhì)是淀粉，約占90%。水稻胚乳中的淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中直鏈淀粉含量高低是影響稻米食味品質(zhì)的關(guān)鍵因素[1]。水稻米直鏈淀粉主要由編碼“結(jié)合于淀粉粒上的淀粉合成酶”(granule-bound starch synthase,GBSS)，即蠟質(zhì)蛋白催化合成[2]。蠟質(zhì)蛋白是由蠟質(zhì)基因(Waxy，Wx)編碼合成[3]。

Hirano等報(bào)道了開花4 d后的水稻種子蠟質(zhì)基因mRNA的積累[4]。蠟質(zhì)基因在開花4 d前種子中的表達(dá)情況目前還未見報(bào)道。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常需構(gòu)建合適的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子按其轉(zhuǎn)錄模式主要分為組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。利用誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子可對(duì)外源基因表達(dá)實(shí)行時(shí)間、空間上的調(diào)控，因此在轉(zhuǎn)基因研究中具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保及生物安全等多方面的價(jià)值[5]。蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子即為一種器官特異性啟動(dòng)子，只在胚乳、胚囊與花粉中表達(dá)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子引導(dǎo)GUS基因表達(dá)形成的藍(lán)色化合物，在成熟種子中能夠均勻分布在整個(gè)稻米的橫切面[7]。但在水稻不同發(fā)育過程中的種子，蠟質(zhì)基因表達(dá)的空間分布狀況目前也未見報(bào)道。

為了對(duì)水稻蠟質(zhì)基因的分子生物學(xué)能夠有更全面的了解，本研究采用RT-PCR方法，分析了開花第2天至第5天種子中mRNA的積累；同時(shí)采用Waxy基因啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因構(gòu)建成重組載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，在純合轉(zhuǎn)基因水稻種子不同發(fā)育階段進(jìn)行GUS活性檢測(cè)。開展本研究有助于人們更全面的了解水稻蠟質(zhì)基因的表達(dá)特點(diǎn)。

注：232 Wx-pro、232 Int.l為水稻232 蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子；Wx frag為水稻232 蠟質(zhì)基因反義DNA片段(756 bp)；LB、RB為T-DNA 的左右邊界；Nos-ter為Nos基因終止子；35 S-pro、35 S-ter為CaMV 35 S基因啟動(dòng)子和終止子；hpt為潮霉素抗性基因；gus為-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh為XhoI；H-HindⅢ；Sa：SalⅠ；P為PstI；E為EcoRI；S為SalI；X為XbaI；B為BamHI。圖1 雙元載體p 13 W 4的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 供試材料

質(zhì)粒：在中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所王宗陽研究員提供的p 13 W 4質(zhì)粒[8]的T-DNA區(qū)段上，含有由蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子引導(dǎo)一段756 bp蠟質(zhì)基因反義片段與gus基因構(gòu)成的融合基因序列(圖1)。

水稻材料：水稻粳稻品種“超2-10”。

1.2 p 1300-HWG載體構(gòu)建、檢測(cè)及轉(zhuǎn)化

將p 13 W 4質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收大片段，用T4DNA連接酶使DNA環(huán)化，得到去除756 bp 蠟質(zhì)基因反義DNA片段后的載體：p 1300-HWG。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH 5 α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑單克隆搖菌，提取質(zhì)粒。通過PCR、酶切和測(cè)序等方法對(duì)p 1300-HWG載體進(jìn)行鑒定。

設(shè)計(jì)PCR引物用于檢測(cè)2個(gè)BamH Ⅰ位點(diǎn)之間756 bp反義蠟質(zhì)基因片段是否被切掉。上游引物Z 21：5’-CTTCCACAGCAACAGCTAGAC-3’與p 13 W 4質(zhì)粒蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子5’上游的一段DNA相同，下游引物W 4 P 2：5’-TAACATACGGCGTGACATCG-3’與p 13 W 4質(zhì)粒gus基因的一段DNA互補(bǔ)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸1 min，30 cycles，最后72 ℃延伸10 min。

制備根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化p 1300-HWG質(zhì)粒，再進(jìn)行PCR鑒定。PCR擴(kuò)增方法同上。

1.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因水稻及純合植株的篩選

分別取“超2-10”水稻幼胚或成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化中的培養(yǎng)基組成、愈傷組織誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化操作、抗性篩選、植株再生和純合植株篩選方法都參照李建粵等[9]的報(bào)道。

1.4 T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株P(guān)CR鑒定和Southern blot分析

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因水稻植株總DNA。同樣采用Z 21和W 4 P 2上、下游引物對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行PCR檢測(cè)。

設(shè)計(jì)能夠與gus基因配對(duì)的上、下游引物。上游引物gus 1：5’-GGAATCCATCGCAGCGTAATG-3’；下游引物gus 2：5’-GCCGACAGCAGCAGTTTCATC-3’。以p 1300-HWG質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出564 bp條帶，用于轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行Southern blot雜交分析的探針。Southern blot檢測(cè)具體操作步驟按照Amersham公司提供的ECL試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 轉(zhuǎn)基因水稻GUS檢測(cè)

對(duì)純合轉(zhuǎn)基因水稻植株在開花10，15，20，25 d不同發(fā)育階段和成熟種子進(jìn)行GUS活性檢測(cè)[10-11]，觀察gus基因表達(dá)部位的變化。

1.6 水稻種子半定量RT-PCR分析

選取開花第2、3、4、5天未成熟“超2-10”水稻幼嫩種子，去除穎殼，用TRIZOL Reagent抽提RNA，然后用甲醛變性電泳法檢測(cè)RNA的質(zhì)量。用RNase-free的DNaseⅠ(Fermentas MBI)處理總RNA中殘留的基因組DNA后，使用生工生物工程公司的AMV First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。以cDNA為模板，actin基因?yàn)閮?nèi)參，Waxy基因?yàn)槟繕?biāo)基因進(jìn)行半定量PCR。Waxy基因擴(kuò)增引物序列見表1。actin基因反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min， 30 cycles， 72 ℃ 延伸10 min；Waxy基因反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性1 min，57 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，30 cycles，72 ℃ 延伸10 min；對(duì)Waxy基因PCR后的電泳條帶進(jìn)行亮度掃描。

表1 RT-PCR試驗(yàn)中所用引物

基因名稱產(chǎn)物(bp)引物名稱正向引物和反向引物actin797actin15' AACTGGGATGATATGGAGAA 3'actin25' CCTCCAATCCAGACACTGTA 3'Waxy999Waxy15' TGGTGATCTCTCCTCGGTAC 3'Waxy25' ACTTCTCCTCCATGCTCTTG 3'

注：M為100 bp DNA Ladder；1為p 1300-HWG質(zhì)粒陽性對(duì)照；2為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账荆?～14為T0轉(zhuǎn)基因植株。圖3 p 1300-HWG轉(zhuǎn)基因T0代植株的鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 p 1300-HWG質(zhì)粒載體鑒定

采用上、下游引物Z 21和W 4 P 2對(duì)p 13 W 4質(zhì)粒進(jìn)行PCR，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 170 bp。如果p 13 W 4質(zhì)粒上的蠟質(zhì)基因反義片段被切除后構(gòu)建的p 1300-HWG載體，預(yù)計(jì)Z 21和W 4 P 2引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度為432 bp。對(duì)p 1300-HWG載體PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，條帶長(zhǎng)度為432 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。再將p 1300-HWG質(zhì)粒送上?；瞪锕緶y(cè)序分析，測(cè)序引物選用上游引物Z 21，測(cè)序結(jié)果顯示p 1300-HWG質(zhì)粒構(gòu)建正確。

注：M為100 bp DNA ladder；1、2為p 1300-HWG質(zhì)粒；3為p 13 W 4質(zhì)粒。圖2 p 1300-HWG質(zhì)粒PCR鑒定

根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果與大腸桿菌中的質(zhì)粒鑒定結(jié)果相同，擴(kuò)增產(chǎn)物同樣是432 bp片段。

2.2 培育轉(zhuǎn)基因水稻及PCR和Southern blot檢測(cè)

利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，共獲得12棵轉(zhuǎn)基因苗，移栽后全部存活。采用Z 21和W 4 P 2引物對(duì)12棵T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。12棵植株均能擴(kuò)增產(chǎn)生清晰的432 bp DNA條帶，并且與陽性對(duì)照質(zhì)粒p 1300-HWG擴(kuò)增結(jié)果一致，非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照沒有PCR擴(kuò)增條帶。由此初步證實(shí)，p 1300-HWG質(zhì)粒的T-DNA區(qū)已整合到轉(zhuǎn)基因植株中。

部分轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot結(jié)果見圖4，其中B9為單拷貝，B8、B10為雙拷貝，B11、B12為三拷貝。Southern blot檢測(cè)結(jié)果表明，外源p 1300-HWG質(zhì)粒的T-DNA區(qū)是以不同拷貝數(shù)整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。

圖4 部分T0代植株Southern blot檢測(cè)

2.3 純合轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育種子GUS活性檢測(cè)

取開花第10、15、20、25天和成熟階段純合的轉(zhuǎn)基因植株種子，將稻米胚乳部位橫切面進(jìn)行GUS染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在開花第10天，GUS檢測(cè)特有的藍(lán)色化合物位于種子的邊緣，但隨著種子發(fā)育，GUS檢測(cè)特有的藍(lán)色化合物逐漸向稻米中心部位擴(kuò)展(圖5)。

2.4 水稻種子發(fā)育前期蠟質(zhì)基因表達(dá)分析

取“超2-10”水稻開花第2、3、4、5天幼嫩種子提取RNA，mRNA反轉(zhuǎn)錄后，對(duì)內(nèi)參基因actin的cDNA模板量進(jìn)行調(diào)平檢測(cè)。開花第2、3、4、5天幼嫩種子cDNA模板量分別為22，15，10，8μL時(shí)，可將內(nèi)參基因actin調(diào)平達(dá)到較好的結(jié)果(圖6 A)。

表2 蠟質(zhì)基因半定量RT-PCR產(chǎn)物電泳圖掃描結(jié)果

DAF(d)2345亮度(Int)05286210

按上述相同cDNA模板量對(duì)蠟質(zhì)基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，同樣進(jìn)行電泳檢測(cè)(圖6 B)。電泳條帶掃描結(jié)果見表2。

注：A為非轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子；B為轉(zhuǎn)基因水稻開花10 d種子；C為轉(zhuǎn)基因水稻開花15 d種子；D為轉(zhuǎn)基因水稻開花20 d種子；E為轉(zhuǎn)基因水稻開花25 d種子；F為轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子。非轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子胚乳顏色呈無色狀態(tài)。開花10 d轉(zhuǎn)基因水稻種子只在胚乳周邊呈現(xiàn)藍(lán)色。開花15 d轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳周邊顯藍(lán)色的范圍明顯比開花10 d的種子增多，并且在胚乳中心部分區(qū)域也有藍(lán)色顯示。轉(zhuǎn)基因水稻開花20 d種子、25 d種子和成熟種子，胚乳周邊和中心都已呈藍(lán)色。圖5 轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育時(shí)期種子GUS檢測(cè)

(上圖：actin基因；下圖：Waxy)注：M為100 bp DNA Ladder；1～4為開花第2、3、4、5天(DAF)幼嫩種子。圖6 蠟質(zhì)基因半定量RT-PCR檢測(cè)

由不同發(fā)育階段幼嫩種子蠟質(zhì)基因cDNA電泳條帶掃描結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，蠟質(zhì)基因在開花第2天還沒有表達(dá)。在開花第3天能夠檢測(cè)到蠟質(zhì)基因已開始表達(dá)。開花第4天蠟質(zhì)基因表達(dá)量比第3天有小幅增加，但在開花第5天，蠟質(zhì)基因表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng)，其表達(dá)強(qiáng)度為第4天的2.4倍。

3 討 論

蠟質(zhì)基因是影響水稻稻米食味品質(zhì)最重要的功能基因。近十多年來，水稻蠟質(zhì)基因研究一直受到科學(xué)界的重視。不論蠟質(zhì)基因低表達(dá)還是高表達(dá)的稻米都具有應(yīng)用價(jià)值。在20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)初，較多科學(xué)家們利用蠟質(zhì)基因的反義序列轉(zhuǎn)化水稻，試圖降低稻米直鏈淀粉含量，從而達(dá)到改良稻米食味品質(zhì)的效果[8,12-13]。2016年Zhou等探究了可溶性淀粉合成酶基因(SSIIIa)和顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因(Waxy)在水稻抗性淀粉合成中的作用，并揭示了SSIIIa與高度表達(dá)的Waxy組合能夠形成高水平的抗性淀粉(RS)[14]。這將有助于培育對(duì)糖尿病人有益的高抗性淀粉含量的保健稻米。

Hirano和Sano從開花4 d至28 d選取了7個(gè)不同階段(開花4，7，10，13，18，23，28 d)的水稻種子，分析了蠟質(zhì)基因mRNA含量，發(fā)現(xiàn)從4 d至18 d，蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA含量逐漸增加，18 d達(dá)到最高，在23 d后基本消失[4]。本研究對(duì)開花第2天至第5天種子中蠟質(zhì)基因mRNA表達(dá)分析的研究結(jié)果，使人們對(duì)蠟質(zhì)基因在稻米中的表達(dá)時(shí)期有了更全面的了解。

作為報(bào)告基因，gus已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的研究中。gus與其他廣泛使用的報(bào)告基因如luc和gfp相比，其檢測(cè)方法快速多樣，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求也不高[15]。2007年鞏艷青等將水稻胚特異性表達(dá)基因OsESG的1.1 kb啟動(dòng)子序列與gus報(bào)告基因構(gòu)建融合表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化分析表明，該序列可以啟動(dòng)gus基因特異性只在水稻胚中表達(dá)[16]。 2016年Lu等將水稻低植酸基因(OsLpa1)啟動(dòng)子與gus基因融合轉(zhuǎn)化水稻，通過不同組織 GUS組織化學(xué)染色確定OsLpa1表達(dá)的組織特異性[17]。本研究采用Waxy基因啟動(dòng)子與gus報(bào)告基因構(gòu)建成重組載體，并轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因水稻。通過對(duì)純合轉(zhuǎn)基因水稻種子不同發(fā)育階段進(jìn)行GUS活性檢測(cè)來分析Waxy基因啟動(dòng)子的表達(dá)部位，該研究結(jié)果拓寬了人們對(duì)蠟質(zhì)基因在稻米中表達(dá)部位的認(rèn)識(shí)。

水稻除了是農(nóng)作物分子生物學(xué)研究的模式植物外，水稻稻米還可被用作生物反應(yīng)器。2007年Sardana等[18]在水稻胚乳中利用谷蛋白基因Gt1啟動(dòng)子成功表達(dá)了重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)。2009年Ning等[19]在水稻胚乳建立的rhGM-CSF的表達(dá)系統(tǒng)中，通過使用胚乳特異性強(qiáng)啟動(dòng)子和最優(yōu)密碼子顯著提高了重組表達(dá)水平，產(chǎn)物可用于治療白細(xì)胞減少癥。2017年Ding等[20]用水稻胚乳作為生物反應(yīng)器，進(jìn)行了生產(chǎn)藥物蛋白、疫苗、功能肽及非蛋白類生物活性物質(zhì)的研究。水稻胚乳是生產(chǎn)重組蛋白的理想平臺(tái)[7]。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，胚乳表達(dá)系統(tǒng)具有成本較低，易于控制生產(chǎn)規(guī)模，儲(chǔ)存能力強(qiáng)，重組蛋白質(zhì)儲(chǔ)存安全性高，不含動(dòng)物源性病原體的優(yōu)點(diǎn)[20]。缺乏高效的胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子，會(huì)限制在谷物胚乳中驅(qū)動(dòng)重組蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)的利用[7]。因此，在胚乳中尋找高效特異表達(dá)啟動(dòng)子研究一直受到人們的重視。Qu et al.曾使用6種在水稻胚乳中特性表達(dá)的谷蛋白基因啟動(dòng)子引導(dǎo)gus基因在水稻種子中表達(dá)，在開花7，12 d和17 d分別進(jìn)行了種子GUS活性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種谷蛋白基因啟動(dòng)子GluA-1、GluA-2、GluA-3、GluB-3引導(dǎo)的gus基因表達(dá)產(chǎn)物始終分布在種子胚乳的邊緣，而且表達(dá)量都較低。GluB-5和GluC啟動(dòng)子引導(dǎo)的gus基因表達(dá)產(chǎn)物，隨著種子的發(fā)育，也是逐漸由胚乳的邊緣向中心擴(kuò)展，而且使用GluC啟動(dòng)子GUS產(chǎn)物含量相對(duì)最高[7]。比較GUS檢測(cè)顯示的特異藍(lán)色化合物分布，蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子的表現(xiàn)更類似于GluC啟動(dòng)子。在本研究及前人研究都發(fā)現(xiàn)，在成熟水稻種子中，蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子引導(dǎo)的gus基因能夠在種子的整個(gè)胚乳中表達(dá)。由此認(rèn)為，在今后利用水稻種子作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白或利用基因工程技術(shù)改良稻米胚乳特性時(shí)，蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子也可以被考慮作為候選的胚乳特性高效表達(dá)的啟動(dòng)子。