張 彥 石 涼 秦 鳳 童曉琪 黃 浩 黃德輝

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061)

暗化型(mln) 家蠶是家蠶體色突變中少見的全齡期表現(xiàn)黑化的突變：突變體幼蟲頭部、胸足、肛板等骨化部位均呈黑褐色，蛹后期為黑色，成蟲期全身包括蛾翅在內(nèi)都有明顯的黑化現(xiàn)象[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，該突變是由家蠶第18連鎖群上的芳香烷基胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因(BmiAANAT)序列突變?cè)斐?，突變基因編碼的芳烷基乙酰轉(zhuǎn)移酶(AANAT)失去了催化多巴胺形成N-乙?；喟桶返墓δ?，致使多巴胺生成過量的黑色素，并隨著表皮鞣化使暗化型家蠶幼蟲和成蟲呈現(xiàn)出黑化現(xiàn)象[3-4]；而正常型家蠶中催化多巴胺形成N-乙?；喟桶返墓δ苤饕苫駼miAANAT與BmiAANAT2編碼的酶來共同承擔(dān)[5]。

暗化型家蠶被發(fā)現(xiàn)以后，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所家蠶育種組的工作人員率先將突變的BmiAANAT基因?qū)氲骄哂袃?yōu)良性狀的實(shí)用品種中，利用暗化型家蠶成蟲體色灰黑的特點(diǎn)，培育出黑白分明的雙親，把家蠶一代雜交種雜交率提高到99%以上，并組配了517(暗化型)×518及四元雜交種皖廣三號(hào)(日系574、576為暗化型)等一系列家蠶雜交組合[6-9]。而且在品種培育過程中，工作人員發(fā)現(xiàn)暗化型品系580分離出了幼蟲期頭、胸足等骨化部位和蛹期后期、蛾期等發(fā)育階段體色均比正常暗化型家蠶著色較淺的群體，為了便于區(qū)分，這些著色較淺的暗化型家蠶被命名為淺580。580與淺580家蠶個(gè)體除在著色上有差別以外，在蟲體形態(tài)、眠起時(shí)間、蟲蛹率等生理方面并沒有差別。我們對(duì)家蠶品系淺580做遺傳調(diào)查后發(fā)現(xiàn)：淺暗化蛾與正常白蛾雜交的F1代全部為正常白蛾，F(xiàn)2、BC1代正常白蛾與淺暗化蛾的分離比分別為3∶1和1∶1；淺暗化蛾自交的后代全部為淺暗化表型，表明淺暗化突變?yōu)殡[性。

雖然暗化型家蠶的突變基因已被定位，黑色素合成代謝途徑上的大部分基因也已經(jīng)被解析，但暗化型家蠶的調(diào)控機(jī)制和對(duì)家蠶抗性方面的影響仍有不少未解之處[10]。淺580作為天然著色較淺的暗化型品系是研究家蠶暗化突變發(fā)生及調(diào)控機(jī)制的優(yōu)良素材，對(duì)其發(fā)生原因的解析能進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)暗化突變機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上采用克隆基因全長(zhǎng)序列和測(cè)定基因相對(duì)表達(dá)量的方式分析了BmiAANAT和BmiAANAT2與淺暗化型家蠶形成的關(guān)系，進(jìn)而探究淺580的發(fā)生機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試家蠶 暗化型家蠶品系580、淺暗化型家蠶品系淺580，均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所家蠶育種組培育并飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，6210B)、DNA Mark、熒光定量PCR試劑盒[TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)，RR420A]，均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑(Trizol Reagent)、瓊脂糖B(A600014)，均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Lightcycle K型熒光定量PCR儀，杭州BIOER公司產(chǎn)品；Allegra 21R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN公司產(chǎn)品；SIM-F140AY65型雪花狀制冰機(jī)，日本SANYO公司產(chǎn)品；Hofer MV-25型紫外透射儀，美國(guó)Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品；2.5 μL、10.0 μL、100.0 μL、1 000.0 μL規(guī)格的移液器，均為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶暗化型突變體黑化程度的觀察與比較 分別在幼蟲期5齡第4天、蛹期末期、蛾期等發(fā)育階段對(duì)家蠶品系580和淺580進(jìn)行觀察，并比較2個(gè)家蠶品系在各時(shí)期、各部位的黑化程度和著色深淺。

1.2.2 家蠶暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2的克隆分析 (1)“Trizol法”提取家蠶樣品總RNA。家蠶品系580和淺580幼蟲飼養(yǎng)到5齡第4天，分別隨機(jī)挑選5頭放入經(jīng)過180 ℃高溫烘干處理3 h的研缽內(nèi)，加入液氮快速將材料研磨成粉末狀，并稱取100 mg加入1 mL Trizol Reagent后震蕩混均，然后靜置10 min使材料充分裂解。隨后依照Trizol Reagent 試劑說明書步驟操作提取總RNA，提取的RNA樣品用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整度，測(cè)定A260/A280、A260/A230的比值及濃度，最后將檢測(cè)合格的樣品總RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成cDNA時(shí)使用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，依照說明書步驟進(jìn)行操作。cDNA提取完成后，對(duì)樣品濃度進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，以家蠶看家基因Actin3作為cDNA質(zhì)量的檢測(cè)基因。經(jīng)檢驗(yàn)合格的cDNA及時(shí)放入-20 ℃冰箱保存。(3)克隆分析。以暗化突變基因BmiAANAT(GenBank登錄號(hào)：DQ256382.1)和BmiAANAT2(GenBank登錄號(hào)：AK383501)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物(引物序列見表1)，來擴(kuò)增2樣品的暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積50 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束控制在4 ℃，PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。把擴(kuò)增的目的條帶切下送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果與基因BmiAANAT的突變類型1(GenBank登錄號(hào)：GQ169236.1)、突變類型2(GenBank登錄號(hào)：GQ169237.1)以及基因BmiAANAT2的全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析比較。

表1擴(kuò)增暗化基因BmiAANAT和BmiAANAT2全長(zhǎng)的引物序列

引物名稱上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)BmiAGCGACACGGTCCCACGAACGATTCATTCAGACAACAACGATACBmiA2TGCTCGGCTCAAGGAGCGAGTTGTTTAACCGTGTTAAATATTTAT

1.2.3 家蠶暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 (1)“Trizol法”提取家蠶樣品總RNA。在蛹期第7 天隨機(jī)挑選家蠶品系580和淺580各5頭為試驗(yàn)材料，依照1.2.2(1)“Trizol法”提取家蠶樣品總RNA項(xiàng)的方法和操作步驟分別提取總RNA。提取的樣品總RNA經(jīng)檢驗(yàn)合格后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2) RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA及熒光定量PCR?；蚪MDNA去除、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA及熒光定量PCR均依照說明書步驟進(jìn)行操作。根據(jù)基因BmiAANAT和BmiAANAT2的序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)熒光定量PCR引物和內(nèi)參引物sw22934(表2)，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法[11]進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定與分析。

表2暗化型相關(guān)基因BmiAANAT、BmiAANAT2和內(nèi)參基因熒光定量PCR引物序列

引物名稱上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)(熒光標(biāo)記)BmiATGAATCTCGCCGTCAATCTGGAAACTCCATCGCTCAAGGTAGBmiA2GTCTTTCAAAGCCGTCGAGTTTAGGATTGGGACATCGAAsw22934TTCGTACTGCTCTTCTCGTCAAAGTTGATAGCAATTCCCT

2 結(jié)果與分析

2.1 580及淺580黑化程度的觀察與比較

對(duì)家蠶品系580及淺580幼蟲期5齡第4天、蛹期末期、蛾期等發(fā)育階段的觀察發(fā)現(xiàn)，2個(gè)家蠶品系的黑化程度在各發(fā)育階段均有明顯的差異：幼蟲期，580品系幼蟲的頭、尾板等骨化部位是黑褐色，而淺580品系骨化部位的顏色為淡褐色(圖1-A)；蛹期末期，復(fù)眼剛著色時(shí)580品系蠶蛹的頭、胸部已經(jīng)有大量黑色素聚集沉淀，呈深黑色，而淺580品系蠶蛹上半部為淡黑色(圖1-B)；蛾期，580品系雌、雄蛾全身為灰黑色，且一般雄蛾顏色較淺，但都比淺580品系的顏色深(圖1-C)。這表明家蠶品系淺580的個(gè)體表皮聚集的黑色素含量比580的個(gè)體低。

A. 5齡第4天，B. 蛹期末期，C. 蛾期；紅色箭頭所示為各發(fā)育階段的家蠶暗化型品系580。圖1 幼蟲期、蛹期、蛾期等發(fā)育階段家蠶品系580與淺580的著色情況對(duì)比圖

2.2 暗化相關(guān)基因BmiAANAT與BmiAANAT2的克隆與分析比較

如圖2-A所示為擴(kuò)增家蠶品系580與淺580暗化突變基因BmiAANAT全長(zhǎng)序列的電泳圖，在圖中2個(gè)樣品均擴(kuò)增出了2條電泳帶，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的電泳帶所含DNA堿基序列相同：下面亮度較暗的1條，均含有1 253 bp堿基序列，與BmiAANAT突變類型1序列一致；上面亮度較高的1條，都含有1 407 bp堿基序列，且和BmiAANAT突變類型2序列相同。圖2-B是擴(kuò)增家蠶品系580與淺580的BmiAANAT2全長(zhǎng)序列的電泳圖，圖中2個(gè)樣品均擴(kuò)增出單一電泳帶，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)這2條電泳帶所含DNA堿基序列也相同。這表明家蠶品系580與淺580在暗化突變基因BmiAANAT突變類型方面是相同的，2個(gè)家蠶品系的BmiAANAT2也沒有產(chǎn)生堿基序列突變；同時(shí)也說明淺580品系的淺暗化型表型不是由這2個(gè)基因的堿基序列突變?cè)斐傻摹?/p>

A. 基因BmiAANAT，B. 基因BmiAANAT2。圖2 擴(kuò)增家蠶品系580與淺580暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2全長(zhǎng)序列電泳圖

2.3 暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定與分析

圖3所示為家蠶品系580與淺580暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2在蛹期第7天的相對(duì)表達(dá)量。在圖3-A中，家蠶品系580暗化突變基因BmiAANAT的相對(duì)表達(dá)量約是家蠶品系淺580的8.3倍；如圖3-B，家蠶品系580暗化突變基因BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量也達(dá)到了家蠶品系淺580相對(duì)表達(dá)量的3.0倍。2個(gè)家蠶品系間，暗化突變基因BmiAANAT和BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量均存在極顯著的差異，且家蠶品系580的2個(gè)暗化突變基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)。推測(cè)BmiAANAT和BmiAANAT2的差異表達(dá)與家蠶品系淺580的形成有一定的內(nèi)在聯(lián)系。

A. 基因BmiAANAT的相對(duì)表達(dá)量，B. 基因BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量；圖中數(shù)據(jù)為平均值，**表示2個(gè)家蠶品系間基因BmiAANAT的表達(dá)量存在極顯著差異(t檢驗(yàn)，P<0.01)。圖3 家蠶品系580與淺580暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2在蛹期第7天的相對(duì)表達(dá)量

3 小結(jié)與討論

早在1961年就有了暗化型家蠶的報(bào)道[12]，從那時(shí)起科研人員對(duì)它的研究就沒有停止過。TSUGEHARA等[13-14]克隆了基因BmiAANAT的cDNA全長(zhǎng)序列，進(jìn)一步研究表明其表達(dá)產(chǎn)物可以是乙酰化多巴胺、色胺、酪胺、真蛸胺等多種物質(zhì)，但沒有發(fā)現(xiàn)BmiAANAT的突變與暗化型家蠶之間的關(guān)聯(lián)。直到中國(guó)科學(xué)院的詹帥等[15]和西南大學(xué)的代方銀等[4]分別通過各自的研究把家蠶暗化突變基因確定為BmiAANAT基因才解析了暗化型家蠶的發(fā)生原因。朱勇等通過進(jìn)一步研究在家蠶中鑒定出了另1條AANAT基因，將其命名為BmiAANAT2，并通過基因敲除技術(shù)證實(shí)該基因編碼的酶也具有催化多巴胺形成N-乙?；喟桶返墓δ躘5]。

基因BmiAANAT與BmiAANAT2編碼的酶相似度高達(dá)57%，其共同的催化底物多巴胺是家蠶表皮硬化及黑色素代謝過程中的一種關(guān)鍵物質(zhì)[5]。多巴胺由酪氨酸經(jīng)酪氨酸羥化酶(TH)作用生成多巴(dopa)，再經(jīng)多巴脫羧酶(DDC)的作用生成[16]，其在家蠶黑色素合成代謝途徑上主要有3個(gè)去向：一是在N-β-丙酰多巴胺合成酶(NBAD synthase)的作用下與β-丙氨酸形成N-β-丙酰多巴胺(NBAD)，最后合成黃褐色的色素，NBAD在酶的水解作用下能分解成多巴胺和β-丙氨酸；二是在AANAT的作用下轉(zhuǎn)化為N-乙?；喟桶?NADA)，NADA繼續(xù)合成無色或透明的色素；三是在一系列酶的催化作用下生成深棕色的多巴胺黑色素[17-19]。BmiAANAT發(fā)生基因突變，編碼無催化功能的AANAT從而使第2條途徑受阻就是暗化型家蠶的發(fā)生原因。

本研究通過克隆基因BmiAANAT和BmiAANAT2的全長(zhǎng)序列和測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量來分析2個(gè)基因與淺暗化型家蠶形成的關(guān)系?？寺『蜏y(cè)序結(jié)果顯示，家蠶品系580與淺580所含BmiAANAT的突變類型是相同的，突變后的基因堿基序列與以前的報(bào)道一致；2個(gè)家蠶品系間BmiAANAT2的堿基序列也無差異。這表明家蠶品系淺580的發(fā)生不是由BmiAANAT和BmiAANAT2堿基序列突變?cè)斐傻摹?/p>

分析熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)量結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)家蠶品系間BmiAANAT和BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量都存在極顯著的差異，且家蠶品系580的2個(gè)暗化突變基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)。結(jié)合幼蟲期5齡第4天、蛹期末期、蛾期等發(fā)育階段580的個(gè)體都表現(xiàn)出比淺580的個(gè)體黑化程度更深的表型特征，可以推斷家蠶品系580個(gè)體內(nèi)的黑色素含量要明顯高于家蠶品系淺580的個(gè)體，且家蠶品系580個(gè)體內(nèi)黑色素的前導(dǎo)物多巴胺含量也應(yīng)該高于家蠶品系淺580。淺580個(gè)體內(nèi)含量較低的多巴胺誘導(dǎo)BmiAANAT，BmiAANAT2的表達(dá)量大幅下調(diào)，生成的多巴胺黑色素也明顯下降，從而表現(xiàn)出淺暗化表型；但多巴胺含量偏低是由黑色素代謝通路上游的TH及DDC活性降低引起的，還是由通路下游的NBAD 合成酶的過量表達(dá)引起的，以及具體的調(diào)控機(jī)理都還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。