劉建川

（西華師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，四川 南充 637000）

在臨床中，生物標(biāo)志物檢測對于臨床診斷及治療方案的制定均具有積極作用，為此，多年來其一直作為臨床醫(yī)學(xué)界及相關(guān)研究人員的主要關(guān)注方向，所呈現(xiàn)出的研究資料眾多。但是，傳統(tǒng)小分子熒光探針在溶解度、集成等方面還存在一定局限性[1]。以往有研究資料顯示，經(jīng)由相應(yīng)的化學(xué)方法應(yīng)用，能夠促使小分子熒光探針融入聚合物體系中，從而形成功能性更為全面的聚合物探針，其與傳統(tǒng)熒光探針進行對比，所呈現(xiàn)出的主要差異是生物相容性有進一步提升，其檢測功能也實現(xiàn)了集成化[2]。在本次研究中，對pH和溫度敏感型聚合物熒光探針的合成及具體應(yīng)用進行了分析，現(xiàn)報告如下。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗儀器

儀器：Bruker Avance 400核磁共振儀NMR，四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)，測定環(huán)境在常態(tài)室溫條件下即可；Waters LCT Premier XE TOF型高分辨質(zhì)譜儀；VARIAN Cary 100型紫外可見吸收光譜儀與CARIAN-Cary型熒光光譜儀；LAKECORE-SO400型超純水器；pHS-25型pH計；Waters1515-2414型凝膠滲透色譜儀，流動相為四氫呋喃。試劑：偶氮二異丁腈（AIBN）分析純，經(jīng)乙醇重結(jié)晶純化；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM），分析純，經(jīng)正已烷重結(jié)晶純化；單氨基-七異丁基POSS，分析純；四氫呋喃（THF），分析純，應(yīng)用前經(jīng)金屬鈉干燥與蒸餾，保存留用。

1.2 方法

1.2.1 NI（N-（2-甲基丙烯酰乙酯基）-4-（N-甲基哌嗪基）-1，8-萘酰亞胺）的合成

在容量為100 mL的實驗專業(yè)容器中，將N-（2-羥乙基）-4-（N-甲基哌嗪基）-1，0-萘酰亞胺（600 mg，1.8 mmol）溶到20 mL干燥二氯甲烷中，然后在此容器中增加三乙胺，劑量為0.25 mL，增加后不斷進行攪拌；將10 mL二氯甲烷溶解的甲基丙烯酰氯溶液，緩慢地注入容器中，本次研究中此環(huán)節(jié)采用滴注的方式，確保溶液能夠維持一定速度緩慢進入容器；將配置好的溶液放置在常溫環(huán)境中，促使其自然反應(yīng)12 h。反應(yīng)后的溶液減壓旋蒸除去溶劑，柱層析色譜分離，二氯甲烷/甲醇，獲取到黃色產(chǎn)物NI 330 mg，產(chǎn)率為46%。

1HNMR（400MHz，CDCI3），δ：1.87（s，3H，-CCH3），2.46（s，3H，-NCH3），2.77（s，4H，-（CH2）2N-），3.32（s，4H，-（CH2）2NCH3），4.47（t，J=5.2HZ，2H，-NCH2-），4.54（t，J=5.2HZ2H，-CH2O-），5.50（s，1H，alkene-H），6.05（s，1H，alkene-H），7.22（d，J=8.0HZ，1H，Ph-J），7.69（t，J=7.2HZ1H，Ph-H），8.40（d，J=8.4HZ，1H，Ph-H），8.25（d，J=8.0HZ1H，Ph=H），8.57（d，J=7.2HZ1H，Ph-H）。HRMS（ESI-MS）：計算值C23H26N3O4[M+H]＋408.192 3，實際測量結(jié)果為408.193 3。

1.2.2 POSS-CTA（雙硫酯基-異丁基-POSS鏈轉(zhuǎn)移劑）的合成

在容量為100 mL的容器中，加入AOPOSS，劑量為2 g，將其溶解到50 mL干燥二氯甲烷中，持續(xù)進行攪拌；在攪拌一定時間后，將2-溴丙酰溴（0.65 g，3 mmol）的20 mL干燥二氯甲烷稀釋液注入容器中，本次研究采用滴注方式，促使其能夠維持一定速度緩慢進入到容器中，將配置完成的溶液放置到常溫環(huán)境中，使其自然反應(yīng)12 h。自然反應(yīng)完成后減壓旋蒸除去溶劑，乙醇重結(jié)晶，真空干燥獲取到白色固體POSS-Br2.08 g，收率87%。

1HNMR（400MHz，CDCI3），δ：0.63-0.58（m，15H，-SiCH2-），0.96（d，J=6.8HZ，42H，-CH（CH3）2-），1.67-1.58（m，2H，-SiCH2CH2-），1.89-1.80（m，7H，-SiCH2CH-），1.89（d，J=6.6HZ，3H，-CHBrCH3），3.27（q，J=6.8HZ，2H，-NHCH2-），4.41（q，J=6.6HZ，1H，-CHBrCH3），6.41（s，1H，-NH-）。HR MS（ESI-MS）：計算值C34H75NO13Si8Br[M+H]＋：1 008.257 6，實測值1 008.257 1。

1.2.3 Poly（POSS-NI-NIPAM）合成

選用容量為25 mL的史萊克管作為容器，首先在容器中加入N-異丙基丙烯酰胺，加入量為0.567 g，5.010 mmol，后加入鏈轉(zhuǎn)移劑POSS-CTA，加入量為35 mg，0.033 4 mmol，后加入NI，加入量為10 mg，0.024 6 mmol，后加入1mL干燥四氫呋喃與AIBN，加入量為2.4 mg，0.016 7 mmol。在所有試劑均添加完成后，進行凍融脫氣循環(huán)，反復(fù)操作3次，完成此項操作后對其進行加熱處理，至65 ℃停止加熱，自然反應(yīng)9 h。將完成反應(yīng)后的液體緩慢滴入到200 mL的冷乙醚中進行沉淀處理，持續(xù)沉淀2次，最終形成顏色為黃色的固體，重量為0.547 g。最終獲得物質(zhì)數(shù)均相對分子質(zhì)量12 565，質(zhì)均相對分子質(zhì)量18 353，多分散性指數(shù)PDI1.46。

2 結(jié)果

2.1 合成與表征

POSS-CTA的合成經(jīng)由兩步有機合成反應(yīng)合成RAFT反應(yīng)鏈轉(zhuǎn)移劑POSS-CTA。（1）AIPOSS與2-溴丙酰溴經(jīng)由親核加成與消除反應(yīng)獲取到熱力學(xué)穩(wěn)定的中間體POSSBr。（2）將丙酮作為溶劑，乙基黃原酸鉀上硫原子親核進攻POSS-Br，生成溴化鉀與鏈轉(zhuǎn)移劑POSS-CTA、此種合成策略較為簡便，且合成過程所應(yīng)用到的原料容易獲取。

2.2 Poly（POSS-NI-NIPAM）結(jié)構(gòu)

從N-異丙基丙烯酰胺開始，以無水四氫呋喃作為溶劑，AIBIA作為鏈引發(fā)劑，POSS-CTA作為鏈轉(zhuǎn)移劑，合成共聚物Poly（POSS-NI-NIPAM）。經(jīng)由1H-NMR與GPC對Poly結(jié)構(gòu)及相對分子質(zhì)量分別進行表征。在Poly核磁共振氫譜中，萘酰亞胺單元中-OCH2CH2N-的亞甲基氫化學(xué)位移出現(xiàn)在4.39位置，茶酰亞胺中甲基哌嗪基團的-CH3甲基氫，聚合物核磁氫譜結(jié)果充分顯示出各單位均成功參與聚合反應(yīng)。GPC測試結(jié)果顯示出，Poly數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）為12 565，質(zhì)均相對分子質(zhì)量（Mw）為18 353，多分散性指數(shù)1.46。此結(jié)果充分證實，應(yīng)用RAFT反應(yīng)生成的聚合物相對分子質(zhì)量可控，且分布均勻。詳細情況如圖1所示。

圖1 Poly在DMSO-d6的核磁共振氫譜圖

針對不同濃度茶酰亞胺單體NI的吸收光譜實現(xiàn)滴定測試，同時將其在400 nm處的吸光度值與質(zhì)量濃度變化做線性關(guān)聯(lián)，獲取公式為：

A：A400=9.944 6c-0.001 14，R=0.999 9，公式中濃度為1.0 g/L Poly溶液在吸收光譜400 nm位置吸光度為A400=0.369 85，代入公式獲取到聚合物中單體NIPAM與NI之間摩爾比為233∶1。

2.3 探針與pH變化響應(yīng)檢測

經(jīng)由對系統(tǒng)測試條件的優(yōu)化，茶酰亞胺單體在乙醇溶液中熒光量子產(chǎn)率較高，將Poly水溶性作為考慮因素，各光譜測試均應(yīng)用V（水）∶V（乙醇）=9∶1體系?？紤]到萘酰亞胺單體NI對pH優(yōu)異的響應(yīng)性能，對聚合物探針Poly處于不同pH條件下實現(xiàn)光譜性質(zhì)試驗。紫外-可見吸收光譜顯示出，在pH從10.0到2.2過程中，Poly最大吸收波長輕微籃移，且在200 nm部位出現(xiàn)等吸收點。應(yīng)用等吸收點400 nm作為激發(fā)波長，在pH為10.0時，Poly初始狀態(tài)的熒光較弱，其原因可能為萘酰亞胺與哌嗪基團臨近氮原子之間PET過程致使萘酰亞胺熒光猝滅。隨著pH的持續(xù)降低，能夠發(fā)現(xiàn)萘酰亞胺中哌嗪單元發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，PET過程在被動狀態(tài)下停止，NI熒光強度逐漸恢復(fù)，熒光強度變化與pH變化呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.4 探針對溫度變化響應(yīng)檢測

為明確熒光探針是否會受到溫度條件的影響，在本次研究中特對探針在溫度變化中的響應(yīng)情況進行了觀察，調(diào)查結(jié)果顯示出，低溫環(huán)境中，可觀察到較為清澈的溶液，隨著溫度的不斷上升，原本清澈的溶液會逐漸渾濁。基于pH=7.14條件，Poly處于25 ℃狀態(tài)下，在400 nm部位吸光度出現(xiàn)顯著變化，代表著聚合物在此過程中發(fā)生從親水到疏水的變化。聚合物體系Poly在520 nm位置熒光在溫度的不斷升高下而有所降低，僅在相轉(zhuǎn)變時，熒光強度會逐漸加強。此結(jié)果代表著在溫度的不斷升高下，萘酰亞胺分子熱運動致使熒光逐漸猝滅，在溫度至LCST時，微環(huán)境從極性變化為非極性，聚合物在溶液中從伸展的線團結(jié)構(gòu)變化為緊密的球狀結(jié)構(gòu)，熒光表現(xiàn)為突然增強。另外，實驗結(jié)果顯示出，探針在pH變化（4.22/10.09）與溫度變化（20～40 ℃）時，Poly熒光強度可逆循環(huán)性能良好，代表著Poly適合成為聚合物熒光傳感器檢測pH/溫度變化的材料。

3 討論

熒光探針是其熒光性質(zhì)能夠在周圍環(huán)境性質(zhì)的轉(zhuǎn)變下而作出適當(dāng)改變的一種熒光性分子，主要作用為探究大分子物質(zhì)的性質(zhì)與行為[3]。熒光探針多應(yīng)用在熒光免疫法中標(biāo)記抗原或是抗體，同時也可應(yīng)用在微環(huán)境中的探測，包括表面活性劑膠束、雙分子膜等[4]。應(yīng)用可逆加成斷裂自由基聚合反應(yīng)設(shè)計合成基于萘酰亞胺染料與N-異丙基丙烯酰胺單體的pH/溫度雙響應(yīng)聚合物熒光探針Poly。

一系列實驗證實，探針在pH變化（4.22/10.09）與溫度變化（20～40 ℃）時，Poly熒光強度可逆循環(huán)性能良好，探針在pH5.8～8.0條件中，pH檢測性能較好，熒光變化與pH成線性相關(guān)，Poly對pH及溫度具有教好可逆循環(huán)檢測性能，代表著Poly適合應(yīng)用在聚合物熒光傳感器檢測pH/溫度變化中[5]。

Poly適合成為聚合物熒光傳感器檢測pH/溫度變化的材料，在生物樣本pH/溫度變化檢測中具有較大應(yīng)用價值。