黃 忍，張煥容，毛從劍，彭純良，孫正楠

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

呼吸道疾病是影響山羊養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病綜合征之一，臨床癥狀通常為流涕、噴嚏、干咳、發(fā)熱、食欲不振等，其中山羊肺炎的發(fā)生常導(dǎo)致很高的病死率。多種病原菌均能引起山羊發(fā)生肺炎，如支原體(Mycoplasma)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)以及鏈球菌(Streptococcus)[1-4]等。多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌均屬于巴氏桿菌科，為革蘭陰性桿菌，是存在于牛、綿羊、山羊等反芻動物以及其他多種動物上呼吸道的常在病原菌和機(jī)會致病菌[5]，當(dāng)體內(nèi)外因素作用使機(jī)體免疫力下降時，該病原菌就會侵入機(jī)體，表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性和較高的致死率。多殺性巴氏桿菌主要引起禽、豬、兔、牛、綿羊、山羊、野生動物感染發(fā)病，主要引起禽霍亂、牛出血性敗血癥、豬肺疫和豬萎縮性鼻炎等[6-7]。人類也會因被貓或者犬咬傷后感染多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致蜂窩織炎和淋巴管炎[8-9]。溶血性曼氏桿菌主要存在于牛、羊鼻咽部等，該菌致病力較強(qiáng)，其產(chǎn)生的白細(xì)胞毒素(LKT)能特異性溶解反芻動物的白細(xì)胞與血小板[10]，引起牛、羊等反芻動物肺炎、新生羔羊急性敗血癥[11]。兩種病原菌單獨(dú)存在時均有很強(qiáng)的致病力，均能致山羊發(fā)病。Waston P J等[12]報(bào)道了多殺性巴氏桿菌引起羔羊的肺炎、敗血癥；李雪霞等[13]從云南某羊場病羊肺臟中分離鑒定出溶血性曼氏桿菌，并確診為曼氏桿菌病。在臨床上，兩者可以繼發(fā)感染或混合感染。馮旭飛等[14]報(bào)道多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌混合感染山羊。目前，多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌在全球范圍內(nèi)均有分布，給養(yǎng)羊業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。2017年10月，四川省樂至縣某羊場突發(fā)羔羊急性死亡，剖檢見肺臟表面有出血點(diǎn)，切面外翻，肺間質(zhì)明顯增寬，刺破有濃汁流出，為典型的肺炎病理變化。為弄清導(dǎo)致該山羊肺炎病例的病原菌，本研究無菌采取肺臟病料分離鑒定病原菌并研究其對Balb/c小鼠的致病性，通過藥物試驗(yàn)篩選敏感藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2017年10月四川樂至縣某羊場急性死亡羔羊肺臟樣品1份，干冰運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動物 綿羊血平板，購自鄭州安徒生物工程股份有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，均購自杭州微生物試劑有限公司；復(fù)方新諾明、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢美唑、慶大霉素、鏈霉素、丁胺卡那、林可霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、亞胺培南、羅紅霉素、阿莫西林、青霉素、萬古霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素共19種藥敏片，均購自杭州微生物試劑有限公司；PremixTaq、DNA Marker Ι，均購自TaKaRa公司；電泳瓊脂糖，購自O(shè)XOID公司；18 g～22 g Balb/c小鼠購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及純培養(yǎng) 采用無菌技術(shù)將燒紅的手術(shù)刀片對病變肺臟表面滅菌并刺破一小口，接種環(huán)無菌取肺組織樣本分別劃線接種于含100 mL/L馬血清的TSA平板和麥康凱平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，觀察平板上生長的菌落，并革蘭染色鏡檢,后挑取單個菌落劃線接種于含100 mL/L馬血清的TSA平板純化培養(yǎng)鑒定，將純化的菌落接種于含100 mL/L馬血清的TSB，于37℃、150 r/min空氣浴搖床中培養(yǎng)18 h用于后續(xù)試驗(yàn)研究，并同時保存菌種。

1.2.2 分離菌的PCR鑒定 微波爐加熱法提取分離菌DNA[15]。采用參考文獻(xiàn)[14]所設(shè)計(jì)的特異性引物對相關(guān)病原菌進(jìn)行PCR鑒定,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)體系10 μL，其中DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，PremixTaq5 μL，加無菌水補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 45 s；共35個循環(huán)；72℃延伸10 min，16℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。

表1 引物信息

1.2.3 分離菌的溶血試驗(yàn)及對Balb/c小鼠的致病性試驗(yàn) 將分離鑒定的細(xì)菌劃線接種于綿羊血瓊脂平板，觀察有無溶血現(xiàn)象。將分離鑒定的多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌分別接種于含100 mL/L馬血清的TSB增菌培養(yǎng)。用無菌生理鹽水將待檢菌液配制成3×108cfu/mL的菌懸液，以0.3 mL每只的劑量分別皮下注射Balb/c小鼠，每種菌注射3只小鼠，對照組3只小鼠注射相同劑量的無菌生理鹽水，注射后觀察小鼠的發(fā)病及死亡情況，并對死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察小鼠組織器官病理變化，并回收培養(yǎng)及鑒定細(xì)菌。

1.2.4 分離菌藥敏性試驗(yàn) 將分離菌接種于含100 mL/L馬血清的TSB培養(yǎng)基，37℃、150 r/min空氣浴搖床培養(yǎng)18 h，調(diào)菌液至5×105cfu/mL。取200 μL菌液于含100 mL/L馬血清的TSA平板，用滅菌棉簽均勻涂布于整個平板，將不同藥敏片間隔一定距離均勻分布貼于培養(yǎng)基表面，平板置37℃恒溫箱培養(yǎng)8 h～12 h，測量抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

從肺臟樣品中分離出2種細(xì)菌，分別命名為K1和K2。K1革蘭染色鏡檢呈兩端著色較深的陰性球桿菌，散在(圖1左)，該菌在100 mL/L馬血清的TSA平板上為邊緣整齊、表面光滑濕潤的露珠狀小菌落，在麥康凱平板上不生長。K2革蘭染色鏡檢呈兩端鈍圓，單個、散在排列的陰性短桿狀(圖1右)，100 mL/L馬血清的TSA平板上為圓形、濕潤、半透明的中等大小菌落；在麥康凱平板上生長良好，形成中間點(diǎn)狀紅色隆起、邊緣粉紅的小菌落。

圖1 分離的兩種革蘭氏陰性桿菌

2.2 分離菌PCR鑒定結(jié)果

采用多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌特異性PCR分別對可疑菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，2種分離菌PCR產(chǎn)物分別對應(yīng)約500 bp和200 bp大小的片段(圖3)，與預(yù)期目的片段相符。結(jié)果表明，分離出的2種細(xì)菌分別為多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌。

2.3 分離菌溶血試驗(yàn)結(jié)果

接種溶血性曼氏桿菌的血瓊脂平板呈明顯的β溶血。多殺性巴氏桿菌在血瓊脂平板上生長良好，但未見溶血現(xiàn)象。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；N.無模板對照；K1.多殺性巴氏桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物；K2.溶血性曼氏桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker；N.Negative control； K1. PCR products ofPasteurellamultocida；K2.PCR products ofMannheimiahaemolytica

圖2 2種分離菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.2 PCR amplification products of the 2 isolated bacteria

2.4 分離菌對Balb/c小鼠的致病性

2組試驗(yàn)動物在接種病原菌9 h后均表現(xiàn)出精神沉郁、身體蜷縮、呼吸加快、停止采食的癥狀。接種溶血性曼氏桿菌的試驗(yàn)小鼠瀕死時四肢拉伸，15 h后死亡；接種多殺性巴氏桿菌的試驗(yàn)小鼠24 h后死亡,對照小鼠無不良反應(yīng)。剖檢試驗(yàn)小鼠見暗紅色肺臟，并從試驗(yàn)小鼠肺臟分別回收到相應(yīng)細(xì)菌。

2.5 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2種病原菌對頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢美唑、慶大霉素、丁胺卡那、諾氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素多西環(huán)素共11種抗菌藥物均高度敏感，對亞胺培南、林可霉素、青霉素均產(chǎn)生了耐藥(表2)。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：“R”表示耐藥；“I”表示中度敏感；“S”表示高度敏感。

Note:“R”means resistance；“I”means intermediate；“S”means high sensitiviry.

3 討論

由多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌引起的山羊肺炎在臨床癥狀上與其他多種病因引起的肺炎難以區(qū)別，因此應(yīng)用細(xì)菌分離、培養(yǎng)特性和染色特性鑒定結(jié)合PCR鑒定是確定是否存在上述兩種病原菌的有效方法。細(xì)菌分離時，根據(jù)細(xì)菌染色特性與菌落形態(tài)特征可初步判斷細(xì)菌類型，本研究分離到的兩種細(xì)菌的染色特性以及分離菌在含100 mL/L馬血清的TSA平板上的菌落形態(tài)符合多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌的特征，其中，分離的溶血性曼氏桿菌能在麥康凱平板上生長，且與溶血性曼氏桿菌在麥康凱平板上生長的特征完全符合，而分離的多殺性巴氏桿菌在麥康凱平板上不生長。2種分離菌的特征與李浩等(2011)和王羽等(2016)報(bào)道的引發(fā)山羊肺炎的主要病原菌的特征一致。PCR作為一種快速檢測技術(shù)以其快速、靈敏等優(yōu)勢在病原的鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用。為了進(jìn)一步確定分離的病原菌，本研究以多殺性巴氏桿菌的kmt特異性基因和溶血性曼氏桿菌的Lkt特異性基因引物經(jīng)PCR鑒定分離的2種細(xì)菌，結(jié)果表明，經(jīng)2種細(xì)菌的特異性引物PCR擴(kuò)增的目的基因與預(yù)期目的基因一致，可確定2種分離菌分別為多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌。表明多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌是導(dǎo)致該山羊肺炎病例的重要病原菌。

本研究中多殺性巴氏桿菌在血平板上呈露滴狀、光滑的不溶血小菌落。這與馬曉菁等[16]所做多殺性巴氏桿菌溶血性試驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)多殺性巴氏桿菌不同的菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)不同，一般認(rèn)多殺性巴氏桿菌的光滑型(S型)菌株對小鼠的毒力最強(qiáng)[17]。本試驗(yàn)所分離的多殺性巴氏桿菌平板培養(yǎng)物是一種光滑型菌落，致病性試驗(yàn)表明，該菌能快速致死Balb/c小鼠。溶血性曼氏桿菌所有血清型菌株都能產(chǎn)生白細(xì)胞毒素，有溶血性，本試驗(yàn)中分離的溶血性曼氏桿菌呈β溶血。通常認(rèn)為致β溶血的菌株均具有較強(qiáng)的致病性，本研究分離鑒定的溶血性曼氏桿菌能快速致死Balb/c小鼠，是具有較強(qiáng)致病性的菌株。本研究分離鑒定的兩種細(xì)菌均能快速致死試驗(yàn)小鼠，是引起山羊死亡的重要病原菌。

有效的抗菌藥物是治療細(xì)菌感主要的手段。本研究選取了19種抗菌藥物對2種病原菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示2種病原菌對頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢美唑、慶大霉素、丁胺卡那、諾氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素11種抗菌藥物高度敏感，該試驗(yàn)結(jié)果為合理選用敏感抗菌藥物治療多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌性羊肺炎提供了依據(jù)。