盧秀嫻，張思遠(yuǎn)，梁昭平，葉賀佳，梅廷媛

(廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣東廣州 510300)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要影響呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等[1]。IBV會引起呼吸困難、腎炎、產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)的下降，給家禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV具有特殊的復(fù)制機(jī)制和RNA聚合酶的校對機(jī)制，使得病毒基因組重組突變率增高，產(chǎn)生許多血清型，目前血清型已知有超過30種[2]，并不斷的出現(xiàn)新變異株,因此監(jiān)測病毒變異和毒力變化對該病防控具有重要意義。

IBV基因組為線性單股正鏈RNA，全長約27.6 kb，編碼小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和纖突蛋白(S)4 種主要結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)S蛋白與宿主細(xì)胞膜上的病毒受體結(jié)合，并通過宿主細(xì)胞的蛋白酶裂解到S1和S2時，病毒包膜可與細(xì)胞膜結(jié)合[3]，病毒纖突能表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性。S1基因是誘導(dǎo)中和抗體的特異位點，可刺激中和血凝抑制抗體產(chǎn)生[4]。只有當(dāng)S1蛋白誘導(dǎo)中和抗體，才能使機(jī)體起到有效地保護(hù)[5]。雖然IBV的遺傳變異可以在基因組中的任何部分發(fā)生，但主要集中在病毒的S1基因。S1蛋白是主要的感染性和致病性的病毒蛋白，結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致的血清型的差異，并直接影響著IBV的致病性和抗原性[6]。IBV不同毒株間核苷酸序列差異可高達(dá)50%及以上[7]。因此，S1基因是國內(nèi)外研究最多的基因。本研究于2017年5月份從江蘇省某肉雞養(yǎng)殖場發(fā)生疑似傳染性支氣管炎的病料中分離到1株IBV，并對IBV分離株的S1基因進(jìn)行克隆、測序和序列遺傳變異分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒來源 采集臨床病料(主要是氣管、肝臟、腎臟等組織)，研碎后加入適量PBS，在-20℃和常溫條件下反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清液加入雙抗(含200 U/mL青霉素和200 μg/mL鏈霉素)混合，作用2 h后，取0.2 mL接種于11日齡 SPF雞胚的尿囊腔，放于37℃培養(yǎng)箱中孵育。36 h～48 h后收取雞胚尿囊液，連續(xù)在SPF雞胚上盲傳3代。

1.1.2 SPF雞胚及主要試劑 11日齡SPF雞胚購自梅里亞實驗動物中心；RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；DNA Marker DL 2 000 購自北京全式金公司；2×Gotap Master Mix購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和核酸染料均購自TIANGEN公司；pMD20-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公布的IBV S1基因組序列，利用 Primer premier 6.0軟件及oligo6.0，針對IBV基因組S1基因的保守基因區(qū)間設(shè)計1對特異性檢測引物IBS1(上游)：5′-TTCAGGTGGCGTTGATAC-3′(下游)：5′-AACCTTGGCCTACTCTGC-3′；根據(jù) S1基因兩端外的保守序列設(shè)計1對擴(kuò)增S1全長基因的引物,引物的理論跨幅為1 722 bp，可將S1基因片段完全覆蓋，引物序列:S1P1(上游)：5′-TTGAAAACTGAACAAAAGA-3′,S1P2(下游)：5′-CCATAACTAACATAAGGGCA-3′。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2 IBV分離株RT-PCR鑒定和S1全長基因擴(kuò)增 提取尿囊液中的病毒基因組RNA，按照天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以合成的cDNA為模板，采用S1基因特異性檢測引物與S1基因全長引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物以110 V、50 mA電流進(jìn)行電泳，約25 min后于凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3 IBV分離株S1基因的克隆測序 按照膠回收試劑盒說明書，回收PCR擴(kuò)增的IBV S1全長基因片段，將回收的PCR產(chǎn)物與pMD20-T克隆載體4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂平板藍(lán)白斑篩選，挑去白色單菌落接種到 LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)振蕩培養(yǎng)12 h后，菌液PCR鑒定后挑取陽性菌液送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司廣州測序部進(jìn)行基因全長序列的測定及拼接。

1.2.4 IBV分離株S1基因的序列分析 應(yīng)用MEGA6.0分析軟件將測定的序列與參考毒株的S1基因序列進(jìn)行比對，繪制遺傳進(jìn)化樹。其中序列比對使用Clustal W多重比對方法，在進(jìn)化樹繪制中選用Neighbor-Joining算法。

2 結(jié)果

2.1 IBV的分離與鑒定

病料進(jìn)行處理與分離培養(yǎng)，利用針對IBV的S1基因特異性檢測引物和S1全長基因的引物，通過RT-PCR對雞胚尿囊液進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果能擴(kuò)增出大小約為500 bp和1 722 bp的2條預(yù)期目的片段，而陰性對照沒有擴(kuò)增出條帶(圖1和圖2)。表明該毒株為IBV，命名為CK/GD/073/2017。

2.2 S1基因序列分析

CK/JS/073/2017基因全長1 635 bp(從起始密碼子ATG到S前體蛋白裂解位點)，編碼545個氨基酸，其裂解位點為HRRRR,這與大多數(shù)中國流行毒株一致，為中國IBV所特有；和50株國內(nèi)外代表及常用疫苗株的S1基因序列進(jìn)行了比較，同源相似性為64.7%～99.4%；與位于同一基因型的參考毒株間同源性較高,與CK/CH/GX/NN11-4株同源性為99.4%，與我國使用的常規(guī)Mass型疫苗毒株的同源性較低，與H120和H52之間的同源性僅80.0%～82.2%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性對照； 2.陰性對照； 3.CK/GD/073/2017

M.DNA Marker DL 2 000； 1.Positive control； 2. Negative control；3.CK/GD/073/2017

圖1分離株S1基因RT-PCR鑒定結(jié)果

Fig.1 RT-PCR identification result of S1 gene of isolate

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性對照 2.陰性對照 3.CK/GD/073/2017

M.DNA Marker DL 2 000； 1.Positive control； 2. Negative control；3.CK/GD/073/2017

圖2分離株S1全長基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 RT-PCR result of S1 full-length gene of isolate

研究證明,病毒基因組RNA的點突變、插入、缺失和不同毒株間的基因重組是造成IBV 變異的主要分子基礎(chǔ)[8]。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)分離株CK/GD/180/2017與其他參考毒株的 S1基因核苷酸序列中存在有大量的點突變外，還伴有堿基的插入、缺失現(xiàn)象，僅在少數(shù)區(qū)域相對保守；其中與H120相比顯示，CK/JS/073/2017株的多處氨基酸位點出現(xiàn)突變，變異主要分別位于19-25、52-79、116-120、196-206、275-292、307-310、375-379 位氨基酸等區(qū)域；IBV 中和抗體產(chǎn)生相關(guān)的抗原位點分別位于 S1 蛋白的24-61、132-149、291-398處氨基酸，抗原相關(guān)區(qū)域存在氨基酸突變、插入和缺失，這可能導(dǎo)致病毒抗原性和血清型的改變，并導(dǎo)致免疫失敗。

2.3 S1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系分析

將測定的分離株IBV 核苷酸序列與參考毒株構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)包括標(biāo)準(zhǔn)毒株在內(nèi)，所有毒株共分為9個基因群，即LX4株、QXIBV株等組成Ⅰ群;英國分離株4/91與UK/7/93 組成基因Ⅱ群;河南分離株 CK/HN/HN99 等組成基因Ⅲ群;廣東分離株CK/CH/GD/ZJ10/2013、HN08株組成基因Ⅳ群；臺灣分離株 TW2575/98 和TW2296/95等組成V群;CK/CH/GX/NN11-4株等組成基因Ⅵ群; JASS株等組成的基因Ⅶ群；腎型分離株 ARK99 株、Holte 株等組成Gray型，疫苗株H120等代表的 Mass型，其中CK/JS/073/2017屬于基因Ⅵ，與H120代表的 Mass型疫苗株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

▲代表分離毒株 ▲Representing the isolate

3 討論

S1基因是研究IBV遺傳變異與進(jìn)化的重要基因，分析S1基因序列有助于監(jiān)控IBV的流行趨勢。本研究對分離毒株 CK/JS/073/2017 的S1基因進(jìn)行序列測定,并與國內(nèi)外已發(fā)表參考株 S1 基因比較,表明 CK/JS/073/2017株S1基因?qū)儆诨颌鋈?，裂解位點為HRRRR ，裂解位點與中國大部分毒株相一致，與國內(nèi)分離株CK/CH/GX/NN11-4株S1基因相似性最高,與常用 Mass型疫苗株相似性較低,與參考毒株 Arkansas、Conn、G ray、793/ B 等血清型同源性差異亦在20%以上。分離毒株與國內(nèi)普遍使用的疫苗毒株 H120、Ma5親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是否發(fā)生重組，是否因為基因的突變、缺失、插入等現(xiàn)象而導(dǎo)致其毒力和致病性增強(qiáng)，仍需驗證。

近年來我國江蘇地區(qū)盡管使用疫苗免疫雞群，但仍頻繁發(fā)生IB[9]，且有新的變異株產(chǎn)生。IBV的基因組變異頻率高，突變形式多樣，血清型眾多,尤其是以 S1基因變異最大[10]。S1基因的點突變、插入、缺失或 RN A重組都可產(chǎn)生新血清型、亞型或變異株，這也是免疫雞群中暴發(fā)IB的主要原因，現(xiàn)有Mass型疫苗可能在該地區(qū)起不到良好的免疫保護(hù)作用[11]。因此，必須對江蘇地區(qū)的流行株進(jìn)行血清定型 ,并對流行株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，有助于更好地了解IBV的變異，從分子水平上揭示 IBV 的變異基礎(chǔ)和規(guī)律,為新型疫苗的研發(fā)提供參考依據(jù)，也為江蘇地區(qū)IB防控提供科學(xué)依據(jù)。