王 巖，楊茜雯，楊 英

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

藍(lán)刺頭(EchinopslatifoliμsTausch)為菊科藍(lán)刺頭屬植物，又名蜀州漏蘆[1]，為嗜礫質(zhì)中生長的旱生植物，主要分布于蒙古、西伯利亞等地區(qū)[2]；藍(lán)刺頭多糖B(Echinopslatifoliμspolysaccharide B，ETPB)為本課題組從植物藍(lán)刺頭花絮中提取的一種分子量單一的多糖，前期研究證明其具有降低糖尿病模型大鼠血糖，抑制大鼠胰島β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生及對細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用[3-4]。其抗凋亡機(jī)制尚不明確，本研究采用體外培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，探究ETPB對由過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡的影響，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞(INS-1)，購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥品及主要試劑 植物藍(lán)刺頭采自呼和浩特市，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)教研室鑒定；1640培養(yǎng)基(SH30809.01)；胎牛血清(FBS,gibco,1099-133)；胰酶(gibco,25200-056)；β-琉基乙醇(Sigam)；噻唑藍(lán) (MTT,Sigma,m2128)；二甲基亞砜(DMSO,DN3039A)；過氧化氫(H2O2，北辰方正試劑廠)；維生素C(VC,Solarbio，A8100)；AO/EB雙染試劑盒(Solarbio,CA1140)；Trizol、RT-PCR(TaKaRa)；SYBR Green Master(Rox)(Roche,04913914001)；Bcl-2、Bax、B-actin單克隆抗體(Santa Cruz)，HRP標(biāo)記IgG二抗(北京康為世紀(jì))；SuperSignal West Femto(thermo,34095)。

1.1.3 主要儀器 熒光倒置顯微鏡(Olympus,Ⅸ71)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo,USA)；全功能酶標(biāo)儀(Synergy H4 Hybrid,USA)；5430R離心機(jī)(Eppendorf,Germany)；IQ5 7500 Fast熒光定量PCR(AB，USA)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE Image Quant LAS 4000)；超純水儀(UPH,成都優(yōu)普)；電泳儀(DYY-12,北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 INS-1細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)條件為RPMI1640中加入100 mL/L胎牛血清(FBS)、100 U/mL雙抗、50 μmol/L β-巰基乙醇。培養(yǎng)于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2環(huán)境，3 d～5 d傳代1次。

1.2.2 藍(lán)刺頭多糖ETPB的提取 根據(jù)文獻(xiàn)[3]，取藍(lán)刺頭干燥花絮，水提醇沉得到粗多糖，酶法除蛋白后使用DEAE-52分級純化，收集0.1 mol/L NaCl洗脫液，透析凍干得ETPB。

1.2.3 ETPB對受H2O2損傷細(xì)胞存活率的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/mL接種至96孔板，200 μL/孔，24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，PBS清洗1次，將細(xì)胞分為①陰性對照組、②陽性對照組、③ETPB組。①、②組給予完全培養(yǎng)基200 μL；③組加入(含ETPB 7.8、15.6、31.2、62.5 μg/mL完全培養(yǎng)基) 200 μL，作用24 h、48 h(平行試驗)后吸出上清，①組加入完全培養(yǎng)基200 μL，②、③加入終濃度50 μm/L的H2O2完全培養(yǎng)基200 μL，作用24 h，棄上清，PBS清洗1次后每孔加入120 μL完全培養(yǎng)基(含20 μL，5 mg/mL，MTT)，37℃孵育4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測OD570值，計算細(xì)胞存活率。每組設(shè)置6個復(fù)孔[5]。

細(xì)胞存活率=(測試組OD570-本底OD570)/(空白組OD570-本底OD570)×100%

1.2.4 ETPB對H2O2損傷細(xì)胞形態(tài)的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后計數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個/mL接種于24孔板，24 h后加藥物處理方法同1.2.3，增加④維生素C組(VC，20 μg/mL)；作用48 h后吸出上清，①加入完全培養(yǎng)基500 μL，②、③、④加入含終濃度50 μm/L，H2O2完全培養(yǎng)基500 μL，作用24 h，棄上清，PBS清洗后，每孔加入含20 g/L AO/EB PBS混合液200 μL，37℃孵育5 min后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 RT-qPCR檢測INS-1細(xì)胞中Bcl-2和Bax基因mRNA表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，同1.2.4處理細(xì)胞加藥，后按照Trizol方法[5]提取總RNA，檢測濃度、純度、完整性后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，按照20 μL體系加入模板、SYRB mix，上、下游引物(表1)，進(jìn)行實時熒光定量PCR，反應(yīng)條件為:95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40循環(huán)，每組4個平行。待測基因相對表達(dá)量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct待測基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot檢測INS-1細(xì)胞中Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理同1.2.4，提取蛋白后使用BCA法檢測蛋白濃度，使用蛋白上樣緩沖液稀釋至同一濃度，按Western blot方法[5]操作，后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集發(fā)光信號，用Image J軟件進(jìn)行積分光密度分析。

2 結(jié)果

2.1 ETPB對受H2O2損傷細(xì)胞存活率的影響

藥物處理24 h、48 h，與陰性對照組相比陽性對照組存活率顯著降低(P<0.05)，降低至79.97%±6.74%、61.67%±3.35%，表明H2O2可損傷細(xì)胞，損傷作用隨被處理細(xì)胞培養(yǎng)時間增加而增強(qiáng)。與陽性對照組相比ETPB各劑量組均能顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.05)，預(yù)處理24 h提高至 92.16%±8.33%，預(yù)處理48 h提高至79.19%±8.02%。表明ETPB預(yù)處理能顯著提高受H2O2損傷細(xì)胞存活率，效果呈劑量依賴性，ETPB 62.5 μg/mL效果最佳；預(yù)處理48 h陽性對照組與各組差值較大，選為后續(xù)試驗條件(表2)。

表2 INS-1細(xì)胞存活率測定結(jié)果

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:The column date followed with different letters are significantly different (P<0.05),and with same letter are not significantly different(P>0.05).

2.2 ETPB對H2O2損傷的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

熒光顯微鏡下觀察，陰性對照組熒光顏色大多為綠色且細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形狀；陽性對照組細(xì)胞核出現(xiàn)大量黃色、橘紅色熒光，細(xì)胞皺縮形態(tài)各異，可觀察到正常、破碎形態(tài)細(xì)胞，提示細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡、壞死。ETPB各組預(yù)處理48 h，發(fā)現(xiàn)黃色、橘紅色熒光少于陽性對照組，31.2、62.5 μg/mL數(shù)量減少明顯。VC組效果與ETPB 31.2 μg/mL相近，提示ETPB具有保護(hù)氧化損傷作用(圖1)。

A:陰性對照組；B:陽性對照組；C:VC(20 μg/mL)；D～G:7.8、15.6、31.2、62.5 μg/mL ETPB；細(xì)箭頭所指為正常細(xì)胞；較粗箭頭所指為凋亡細(xì)胞；粗箭頭所指為壞死細(xì)胞

A:Negative control group; B:Positive control group; C:VC 20 μg/ml treated; D-G:7.8,15.6,31.2,62.4 μg/mL ETPB treated.Fine arrows point to as normal cells; Coarser arrows point to as apoptotic cells; coarse arrows point to necrotic cells

圖1 ETPB、VC處理48 h對受H2O2損傷INS-1細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

Fig.1 Morphology changes of INS-1 cells damaged by H2O2after treatment with ETPB and VC (×200)

2.3 ETPB對INS-1細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

Bcl-2結(jié)果顯示，與陰性對照組1.065±0.171相比，陽性對照組Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，為0.720±0.130；與陽性對照組相比，ETPB預(yù)處理各組均可顯著提高Bcl-1表達(dá)量(P<0.05)并呈劑量依賴，62.5 μg/mL組表達(dá)量達(dá)到1.448±0.369，顯著高于陰性對照組(P<0.05)；陽性藥物VC組表達(dá)量為1.330±0.209，與EPTB 15.6 μg/mL相近(表3)。

Bax結(jié)果顯示，與陰性對照組1.080±0.470相比，陽性對照組Bax表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，達(dá)到6.345±0.982；與陽性對照組相比，ETPB預(yù)處理各組均可顯著降低Bax表達(dá)量(P<0.05)并呈劑量依賴，最低為62.5 μg/mL組1.542±0.386，與陽性藥物VC組1.705±0.201相比差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2.4 ETPB對INS-1細(xì)胞 Bcl-2、Bax 蛋白含量影響

Bcl-2結(jié)果見圖2，與陰性對照組相比，陽性對照組Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，ETPB各濃度及VC組Bcl-2表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)； 7.8 μg/mL、15.6 μg/mL、31.2 μg/mL表達(dá)量與VC組差異相比不顯著(P>0.05)，62.5 μg/mL表達(dá)量顯著高于陰性對照組(P<0.05)。

表3 各組Bcl-2、Bax mRNA相對表達(dá)

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)、字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:The column date followed with different letters are significantly different (P<0.05),and with same letter are not significantly different(P>0.05).

Bax結(jié)果見圖3，與陰性對照組相比，陽性對照組Bax表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與陽性對照組相比，ETPB各濃度及VC組Bax表達(dá)量均降低，其中7.8 μg/mL、15.6 μg/mL組差異不顯著(P>0.05)，31.2 μg/mL、62.5 μg/mL、VC組差異顯著(P<0.05)；7.8、15.2、31.2 μg/mL組表達(dá)量高于顯著VC組(P<0.05)，62.5 μg/mL與VC組差異相比不顯著(P>0.05)。

N.陰性對照組；P.陽性對照組；VC.20 μg/mL

N.Negative control group; P.Positive control group; VC.20 μg/mL

圖2 ETPB對氧化損傷細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)影響

Fig.2 Effect of ETPB on Bcl-2 protein expressions in
oxidative damaged INS-1 cells

N.陰性對照組；P.陽性對照組；VC.20 μg/mL

N.Negative control group; P.Positive control group; VC.20 μg/mL

圖3 ETPB對氧化損傷細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)影響

Fig.3 Effect of ETPB on Bax protein expressions in
oxidative damaged INS-1 cells

3 討論

研究表明，氧化應(yīng)激是引起Ⅱ型糖尿病的重要原因[6]，胰島β細(xì)胞數(shù)量減少是Ⅱ型糖尿病發(fā)生的重要機(jī)制[7-8]，而數(shù)量減少主要原因則為凋亡[8]。因此，對氧化應(yīng)激造成胰島β細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的探究對糖尿病的防控有重要意義。細(xì)胞凋亡在細(xì)胞發(fā)育及疾病發(fā)生中均起著重要作用[9]，凋亡過程中不僅發(fā)生細(xì)胞個體的變化，還具有特征性形態(tài)和亞結(jié)構(gòu)變化[10]。本試驗采用使用較為廣泛的H2O2模擬氧化應(yīng)激，50 μm/L作用INS-1細(xì)胞24 h，MTT結(jié)果顯示與陰性對照相比細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，與韓飛等[11-12]研究相符；使用可以在熒光顯微鏡下區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞的AO/EB染色法觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增多，表明氧化應(yīng)激模型建立成功[10]。ETPB干預(yù)24 h、48 h后使用MTT法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果顯示ETPB各組與陽性對照組相比均可顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.05)；作用48 h進(jìn)行AO/EB染色觀察，結(jié)果顯示ETPB各組凋亡、壞死細(xì)胞明顯少于陽性對照組，細(xì)胞形態(tài)與VC組相近，與低劑量VC具有抗氧化應(yīng)激作用研究[13]相符。證實ETPB可保護(hù)由H2O2造成的細(xì)胞存活率降低并抑制細(xì)胞凋亡。在已知具有調(diào)節(jié)凋亡功能的蛋白中，Bcl-2家族(2型淋巴細(xì)胞樣蛋白) 在各類信號刺激引起凋亡的過程中具有重要作用[14]。Bcl-2能抑制細(xì)胞凋亡，Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2較高表達(dá)時可形成Bcl-2/Bax，其為具有有抑制細(xì)胞凋亡功能的異二聚體；Bax較高表達(dá)時可形成Bax/Bax，其為具有引起細(xì)胞凋亡功能的同二聚體[15]。兩者表達(dá)量的相對比值是判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的重要參照[8]。本研究中，RT-qPCR及Western blot檢測結(jié)果顯示H2O2陽性對照組的Bcl-2表達(dá)量在mRNA及蛋白水平表達(dá)量均降低，與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)；Bax表達(dá)量升高，與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)；引起B(yǎng)cl-2/Bax比值降低。EPTB干預(yù)組與陽性對照組相比Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；Bax表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值升高。ETPB效果呈現(xiàn)一定劑量依賴性，最高濃度62.5 μg/mL效果最佳。

綜上所述，ETPB具有抗H2O2引起INS-1細(xì)胞凋亡作用，其作用機(jī)理可能是通過促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)。