王玉強(qiáng)，李紅娟，蔣天靚，曹亦菲，楊 軍，2，*

（1. 杭 州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州310016；2. 浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003）

順鉑(cisplatin)自研制成功以來(lái)已經(jīng)成為治療多種腫瘤的一線藥物，如卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、肺癌等[1-2]。DNA是順鉑作用的重要靶點(diǎn)，可以誘導(dǎo)鏈內(nèi)交聯(lián)(intrastrand crosslink)、鏈間交聯(lián)(interstrand crosslink)、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA-protein crosslink)等的形成，從而激活細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)(cellular stress response)，最終可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或者細(xì)胞死亡[3-4]。但是對(duì)順鉑的耐藥是困擾其臨床應(yīng)用的一個(gè)重大問(wèn)題，因此，更加深入了解順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制可以為改善順鉑的治療效果提供新的思路和靶點(diǎn)。

針對(duì)這一問(wèn)題，我們嘗試通過(guò)對(duì)基因表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)和鑒定與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的基因和信號(hào)通路。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑作用宮頸癌HeLa細(xì)胞后可導(dǎo)致許多基因表達(dá)水平的改變，包括已知的p53、p21、NDRG2、Bcl-2等基因[5-7]。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)了許多未被報(bào)道的參與順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的基因，如人源泛素結(jié)合酶E2 A(ubiquitinconjugating enzyme E2 A，UBE2A)基因。UBE2A基因的研究相對(duì)較少，其功能仍然不明確，但已有的研究結(jié)果提示它可能是一種與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有一定的關(guān)系[8]。因此，本研究針對(duì)UBE2A在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的作用開展了進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa細(xì)胞株為楊軍教授課題組保存；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶-EDTA、青/鏈霉素均購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Biological Industries；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNA提取試劑盒RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM均購(gòu)自日本TaKaRa公司；PCR試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；CCK-8試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Hydragene公司；順鉑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人UBE2A基因特異性siRNA Oligomer和陰性對(duì)照(RNAi negative control)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，人UBE2A基因特異性siRNA Oligomer 包括針對(duì)轉(zhuǎn)錄本1(NM_003336.3)的UBE2A-homo-434、UBE2A-homo-461和針對(duì)UBE2A基因全部轉(zhuǎn)錄本的UBE2A-homo-257、UBE2A-homo-468。具體序列見表1。

表1 人UBE2A基因特異性siRNA Oligomer序列

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(內(nèi)含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 PCR擴(kuò)增目的基因

根據(jù)GenBank報(bào)告的基因序列，利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物，由上海生工合成。引物序列：上游5"-AACCCGAGACCCCAGTGTAT-3"；下游5"-GGACTCCAACGGTTCTGAAGT-3"，預(yù)測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度為339 bp。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞分別接種于6孔板，在貼壁細(xì)胞鋪滿底面積的70%~90%時(shí)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組加入順鉑儲(chǔ)存液(1 mmol/L)至終濃度為 10 μmol/L， 對(duì) 照 組 加 入 等 體 積 PBS。 24 h后 用RNAiso Plus提取兩組細(xì)胞的總RNA，Nano Drop 2000檢測(cè)總RNA濃度及純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后PCR擴(kuò)增目的基因，PCR反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物取10 μL，加入2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，紫外成像分析儀照相保留結(jié)果。

1.4 細(xì)胞處理?xiàng)l件及RNA提取

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞分別接種于6孔板，在貼壁細(xì)胞鋪滿底面積的70%~90%時(shí)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組加入順鉑儲(chǔ)存液(1 mmol/L)至終濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 μmol/L，對(duì)照組加入等體積PBS。再分別于12、24、48 h后用RNAiso Plus提取各組細(xì)胞的總RNA，Nano Drop 2000檢測(cè)總RNA濃度及純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增目的基因及瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法同1.3。

1.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

根據(jù)GenBank報(bào)告的基因序列，利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)2對(duì)PCR引物，由上海生工合成。引物1用來(lái)檢測(cè)UBE2A轉(zhuǎn)錄本1的表達(dá)，序列為：上游5"-ACCA CCTACAGTTAGATTTGTCTCT-3"；下游5"-CCTGGCTG TTTGCTGGACTA-3"；引物2用來(lái)檢測(cè)UBE2A全部轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，序列為：上游5"-TAGTCCAGCAAACAGCC AGG-3"；下游5"-AAACTGTACCCGGGGTCAAC-3"。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞分別接種于24孔板，在貼壁細(xì)胞鋪滿底面積的70%~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行。先將20 pmol siRNA Oligomer(實(shí)驗(yàn)樣品)或RNAi Negative Control Oligomer(陰性對(duì)照) 稀釋于50 μL的DMEM培養(yǎng)液中(無(wú)血清)，輕柔混勻。再將1 μL脂質(zhì)體LipofectamineTM2000稀釋于50 μL的DMEM培養(yǎng)液中(無(wú)血清)，輕柔混勻，室溫靜置3~5 min。將上述兩液體混合，室溫靜置20 min。將混合液加入24孔板中混勻。轉(zhuǎn)染24 h后，用RNAiso Plus提取各組細(xì)胞的總RNA，Nano Drop

2000檢測(cè)總RNA濃度及純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組不同樣本的CT值 (基本循環(huán)數(shù)) 以及各組樣本中內(nèi)參GAPDH的CT值 ，按照?CT= CT，目標(biāo)- CT，參照，值RQ。結(jié)束后記錄實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組(等體積無(wú)血清培養(yǎng)基)及陰性對(duì)照組(RNAi negative control)的法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組與對(duì)照組之間UBE2A mRNA 表達(dá)量的關(guān)系。

1.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及聯(lián)合順鉑作用

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞分別接種于6孔板，在貼壁細(xì)胞鋪滿底面積的70%~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組分別加入U(xiǎn)BE2A-homo-434、UBE2A-homo-257 siRNA Oligomer，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染5 h后，消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)接于96孔板，設(shè)置空白組(只含培養(yǎng)基不含細(xì)胞)、對(duì)照組(含細(xì)胞)、順鉑處理組、UBE2A-homo-434實(shí)驗(yàn)組和UBE2A-homo-257實(shí)驗(yàn)組，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后，各組(除對(duì)照組)分別加入順鉑儲(chǔ)存液(1 mmol/L)至終濃度為10 μmol/L，對(duì)照組加入等體積PBS。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h，選擇450 nm波長(zhǎng)，參考波長(zhǎng)為650 nm，測(cè)定D(450)值，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 順鉑作用后UBE2A mRNA表達(dá)水平

利用RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)順鉑作用后HeLa細(xì)胞中UBE2A mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物為2個(gè)條帶，其中對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)產(chǎn)物339 bp的條帶較亮，而對(duì)應(yīng)于249 b p位置的條帶較弱，未見其他明顯非特異性擴(kuò)增雜帶及拖尾現(xiàn)象(圖1)。為明確這2個(gè)條帶是否都是UBE2A轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，我們對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，根據(jù)探針序列及測(cè)序結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)條帶都是UBE2A轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中249 bp條帶與339 bp條帶相比，缺少了UBE2A基因外顯子4的部分序列。該結(jié)果提示在HeLa細(xì)胞中，正常情況下UBE2A基因表達(dá)至少兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本。為方便進(jìn)一步研究，我們將339 b p條帶命名為轉(zhuǎn)錄本1(U-1)，249 bp條帶為轉(zhuǎn)錄本2(U-2)。在順鉑作用HeLa細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)U-1和U-2的表達(dá)水平均升高(圖1)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，我們還檢測(cè)了順鉑終濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 μ mol/L及作用時(shí)間分別為12、24、48 h時(shí)U-1和U-2的表達(dá)水平，證實(shí)了上一實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，并發(fā)現(xiàn)順鉑濃度為10μmol/L，作用時(shí)間24 h 時(shí)效果最明顯，見圖1。

圖1 10 μmol/L順鉑作用24 h后UBE2A mRNA表達(dá)水平

2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后UBE2A mRNA表達(dá)水平

為進(jìn)一步研究UBE2A基因的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)U-1的siRNA(UBE2A-homo-434和UBE2A-homo-461)；針對(duì)U-2的siRNA由于序列問(wèn)題無(wú)法成功設(shè)計(jì)，因此只能設(shè)計(jì)針對(duì)全部轉(zhuǎn)錄本的siRNA(UBE2A-homo-257和UBE2A-homo-468)。其中針對(duì)U-1的UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-461 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后采用qPCR檢測(cè)U-1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)U-1表達(dá)水平均降低，U-1表達(dá)量分別為對(duì)照組的27.43%、78.31%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，結(jié)果見圖2。因此UBE2A-homo-434 siRNA轉(zhuǎn)染后U-1表達(dá)水平更低，干擾效果更好。

圖2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后U-1表達(dá)水平

同樣對(duì)針對(duì)UBE2A全部轉(zhuǎn)錄本的UBE2A-homo-257 siRNA和 UBE2A-homo-468 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后采用qPCR檢測(cè)UBE2A mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)UBE2A mRNA表達(dá)水平均降低，UBE2A mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的15.81%、21.20%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，結(jié)果見圖3。因此UBE2A-homo-257 siRNA轉(zhuǎn)染后UBE2A mRNA表達(dá)水平更低，干擾效果更好。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA 進(jìn)行研究。

圖3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后UBE2A mRNA表達(dá)水平

2.3 UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HeLa細(xì)胞在順鉑作用下存活率的影響

使用UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA轉(zhuǎn)染HeLa后，CCK-8檢測(cè)順鉑作用后細(xì)胞存活情況。結(jié)果顯示，順鉑處理組、UBE2A-homo-434實(shí)驗(yàn)組、UBE2A-homo-257實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率分別為78.79%、64.33%、59.59%，轉(zhuǎn)染UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA的HeLa細(xì)胞與對(duì)照和順鉑處理組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，結(jié)果見圖4。這一結(jié)果提示，抑制 UBE2A轉(zhuǎn)錄本1或全部轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，可增加HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的敏感性，降低其存活率。

3 討 論

順鉑作為最常用有效的化療藥物之一，廣泛用于多種實(shí)體瘤包括宮頸癌的治療[9]。但在許多患者中順鉑耐藥限制了其療效，影響了患者的預(yù)后。有研究顯示，通過(guò)下調(diào)宮頸癌HeLa細(xì)胞中STAT3、Livin、Survivin基因的表達(dá)水平，均能夠提高對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的敏感性[10-12]。在前期基因芯片研究中我們發(fā)現(xiàn)，順鉑作用宮頸癌HeLa細(xì)胞后UBE2A基因表達(dá)水平發(fā)生改變，提示UBE2A可能參與了順鉑引起的HeLa細(xì)胞DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)。在本研究中，我們進(jìn)一步證明了UBE2A可被順鉑誘導(dǎo)表達(dá)。更值得注意的是在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該基因具有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中一個(gè)缺少了外顯子4的部分序列(U-2)。

圖4 抑制UBE2A表達(dá)及順鉑作用后各組細(xì)胞存活率

一個(gè)基因的不同轉(zhuǎn)錄本往往是變異剪接(alternative splicing)的產(chǎn)物。變異剪接是高等真核有機(jī)體在發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)控基因表達(dá)的一種主要機(jī)制，變異剪接能夠調(diào)控一個(gè)蛋白是否被表達(dá)，或產(chǎn)生編碼具有不同功能蛋白的pre-mRNAs，研究發(fā)現(xiàn)，接近94%的人類基因編碼可發(fā)生變異剪接[13]。我們和他人在前期研究中已發(fā)現(xiàn)在外源化學(xué)物誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中會(huì)出現(xiàn)變異剪接，而這些變異剪接異構(gòu)體可能通過(guò)不同的方式對(duì)原來(lái)的蛋白功能發(fā)生影響，從而調(diào)控細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)[14-15]。因此，對(duì)于UBE2A基因的兩個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本的功能研究就成為我們的關(guān)注重點(diǎn)。

RNAi作為一種干擾或封閉基因表達(dá)的工具而被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中。本研究初始計(jì)劃設(shè)計(jì)兩組siRNA，分別針對(duì)人UBE2A基因的轉(zhuǎn)錄本U-1和U-2，但由于兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本間差異較小，無(wú)法設(shè)計(jì)出針對(duì)U-2的siRNA，因此改為針對(duì)UBE2A基因全部轉(zhuǎn)錄本的siRNA。本研究采用RNAi技術(shù)成功降低了UBE2A全部轉(zhuǎn)錄本(包括U-1和U-2)在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)，再次證實(shí)了RNAi的有效性。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA的HeLa細(xì)胞與對(duì)照組相比，在順鉑處理后其存活情況出現(xiàn)明顯差異，存活率較順鉑處理組分別下降了14.46%和19.20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，單純抑制U-1表達(dá)與抑制全部轉(zhuǎn)錄本(U-1和U-2)相比，盡管有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但推測(cè)U-1可能起著較為重要的作用。當(dāng)然，從表達(dá)量比較，由于U-1表達(dá)顯著高于U-2，可能掩蓋了U-2的真實(shí)作用。因此，下一步我們將深入挖掘U-2 的生理學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，本研究利用RNAi技術(shù)成功降低了UBE2A全部轉(zhuǎn)錄本(包括U-1和U-2)在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)，并由此顯著提高HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的敏感性，提示UBE2A可能參與了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。本研究充實(shí)了UBE2A基因的功能研究，為改善順鉑的治療效果提供新的思路和靶點(diǎn)。