鮑玲玲，李至敏，王小琴，湯亞蘭，許文武，李志敏*

(1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江西 南昌 330045)

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種嗜鹽革蘭氏陰性細(xì)菌，多存在于溫帶沿海地區(qū)的軟體貝類(lèi)體內(nèi)[1]，該菌屬于條件致病菌，在合適的條件下會(huì)感染魚(yú)和人類(lèi)[2]。人類(lèi)感染創(chuàng)傷弧菌主要是通過(guò)生食帶有該菌的海鮮或傷口接觸了帶菌的海水，從而導(dǎo)致腸胃炎、原發(fā)性敗血癥、慢性肝炎或肝硬化、軟組織感染等疾病[3-4]。創(chuàng)傷弧菌的生物多樣性復(fù)雜，可分為3大類(lèi)型，其中生物類(lèi)型Ⅰ普遍感染人類(lèi)[5]，生物類(lèi)型Ⅱ主要感染魚(yú)類(lèi)貝類(lèi)[6]，生物類(lèi)型Ⅲ于1996年首次在以色列被分離得到，是由來(lái)源于自然環(huán)境的類(lèi)型Ⅰ和其他細(xì)菌通過(guò)基因重組進(jìn)化而來(lái)[7-8]。

在大腸桿菌中， FrsA蛋白通過(guò)和去磷酸化的IIAGlc蛋白結(jié)合可以提高葡萄糖的發(fā)酵水平[9]。研究表明，當(dāng)用葡萄糖作為碳源時(shí)，敲除FrsA基因會(huì)提高大腸桿菌的呼吸水平，而過(guò)表達(dá)FrsA基因會(huì)提高發(fā)酵導(dǎo)向的代謝水平[9]。盡管FrsA蛋白在葡萄糖代謝方面具有生理意義，但有關(guān)重組FrsA蛋白的體外生化功能的研究報(bào)道較少。2011年，Lee等[10]首次表達(dá)純化了創(chuàng)傷弧菌的FrsA蛋白(VvFrsA)，并研究了重組VvFrsA蛋白的體外生化功能，發(fā)現(xiàn)VvFrsA可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行可溶性表達(dá)，同時(shí)VvFrsA是一種不依賴(lài)于焦磷酸硫胺素(TPP)輔因子的丙酮酸脫羧酶，在體外能夠催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和二氧化碳[10]。然而，Kellet等[11]指出，VvFrsA蛋白并不是一種丙酮酸脫羧酶，當(dāng)以丙酮酸作為底物時(shí)，并未檢測(cè)到乙醛和二氧化碳的產(chǎn)生。與此同時(shí)，計(jì)算化學(xué)的研究也證明，重組VvFrsA蛋白不具備丙酮酸脫羧功能[11]。目前，僅有乳清苷5′-單磷酸脫羧酶和2-氧-4-羥基-4-羧基-5-脲基咪唑啉脫羧酶等兩類(lèi)不依賴(lài)輔因子的脫羧酶被報(bào)道[12-13]。因此，重組VvFrsA蛋白的體外生化功能依然存在爭(zhēng)議。

通過(guò)氨基酸序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中和VvFrsA的氨基酸序列同源的蛋白質(zhì)大多數(shù)被標(biāo)注為酯酶。此外，已有的重組VvFrsA蛋白的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明，VvFrsA中存在α/β水解酶結(jié)構(gòu)域[10-11]。因此，筆者猜測(cè)重組VvFrsA蛋白可能具有催化某些酯類(lèi)水解功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究通過(guò)分子生物學(xué)手段將化學(xué)法合成的VvFrsA基因連接到pET-28a載體上，構(gòu)建了pET28a-VvFrsA表達(dá)質(zhì)粒，探究了VvFrsA蛋白的表達(dá)條件及純化步驟，并初步闡明了其作為酯酶的催化特性，為進(jìn)一步探索VvFrsA蛋白的體外生化特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

創(chuàng)傷弧菌的FrsA基因(VvFrsA)由上海祥音生物技術(shù)有限公司合成；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET-28a由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、5k核酸Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Thermo Scientific公司；對(duì)硝基苯酚乙酸酯(pNPA)、對(duì)硝基苯酚丁酸酯(pNPB)和對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)均為分析純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pET28a-VvFrsA質(zhì)粒構(gòu)建 化學(xué)法合成包含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的VvFrsA基因。該基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，利用瓊脂糖凝膠回收片段，將該片段與同樣酶切的pET-28a載體用T4連接酶在16 ℃下過(guò)夜連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,驗(yàn)證陽(yáng)性克隆并送檢測(cè)序。

1.2.2 重組VvFrsA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將測(cè)序正確的pET28a-VvFrsA質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中，挑取陽(yáng)性單克隆點(diǎn)接種于含卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，次日按1%的接種量接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，立即冰水浴30 min，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，于25 ℃、180 r/min的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)表達(dá)24 h。然后于4 ℃、5 000 r/min離心15 min收集菌體。將菌體用10倍體積的20 mmol/L PBS緩沖液重懸后于冰水浴中超聲破碎，然后于4 ℃、12 000 r/min離心破碎后的細(xì)胞全菌液2 h。將經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后的上清液樣品流穿事先用結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5)平衡好的Ni-NTA柱，隨后用含20～200 mmol/L咪唑的緩沖液進(jìn)行濃度梯度洗脫，分別收集每個(gè)濃度的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白。合并含有重組VvFrsA蛋白的洗脫液，濃縮脫鹽處理，最終得到的VvFrsA蛋白用Bradford方法進(jìn)行定量。

1.2.3 重組VvFrsA蛋白底物特異性測(cè)定 重組VvFrsA蛋白對(duì)pNPA、pNPB和pNPP 3種對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯底物的催化活性根據(jù)Vorderwülbecke等[14]提出的酯酶檢測(cè)方法適當(dāng)修改后測(cè)定。首先將上述3種底物分別溶解于異丙醇中構(gòu)成溶液1，底物濃度均為1 mmol/L。同時(shí)配置含有0.4%Triton X-100的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.5)構(gòu)成溶液2。測(cè)定前將溶液1和2均置于37 ℃恒溫水浴。測(cè)定時(shí)將溶液1和溶液2按1∶9的比例混合后加入終濃度為20 μmol/L的重組VvFrsA蛋白，于37 ℃開(kāi)始反應(yīng)，使用紫外分光光度計(jì)連續(xù)監(jiān)測(cè)410 nm處吸收值。根據(jù)對(duì)硝基苯酚在410 nm處的摩爾消光系數(shù)計(jì)算生成的產(chǎn)物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-VvFrsA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將從陽(yáng)性單克隆菌落中提取的重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)2個(gè)條帶，如圖1所示，接近5 000 bp的大片段為pET-28a載體片段，小片段基因約為1 200 bp，與VvFrsA基因理論大小(1 248 bp)相符?；驕y(cè)序發(fā)現(xiàn)該1 200 bp片段基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為HM172799的FrsA基因序列一致?？梢?jiàn)，成功構(gòu)建了pET28a-VvFrsA重組表達(dá)質(zhì)粒。

M：5k核酸Marker；1：pET28a-VvFrsA表達(dá)

2.2 重組VvFrsA蛋白的表達(dá)與純化

VvFrsA基因的堿基數(shù)為1 248 bp，編碼含有415個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為47.014 ku，與圖2中泳道1、2、3中條帶基本一致。由圖2可知，重組VvFrsA蛋白的表達(dá)量較高，且在上述表達(dá)條件下重組蛋白的溶解性較好。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：細(xì)胞破碎液全菌；

將含有目的蛋白的上清液用Ni-NTA親和層析柱純化。用含有20～200 mmol/L咪唑的緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5)進(jìn)行洗脫(圖3)。當(dāng)咪唑濃度增加到80 mmol/L時(shí)，有少量重組VvFrsA蛋白被洗脫。然后用含200 mmol/L咪唑的緩沖液將重組VvFrsA蛋白全部洗脫。合并圖3中泳道8—9的洗脫液后濃縮脫鹽，得到純度大于95%的重組VvFrsA蛋白。用Bradford方法對(duì)濃縮后的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，最終得到蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL，蛋白質(zhì)回收率約為15 mg/g菌體。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：離心后上清液；2：流穿液；

2.3 重組VvFrsA蛋白的底物特異性

按照上述測(cè)定方法，當(dāng)分別用pNPA、pNPB和pNPP作為底物時(shí)，加入重組VvFrsA蛋白后，反應(yīng)體系在410 nm處的吸收值逐漸增加。由此可知，重組VvFrsA蛋白可以催化pNPA、pNPB和pNPP 3種對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯的水解反應(yīng)，生成對(duì)硝基苯酚。由圖4可知，當(dāng)用pNPA作為底物時(shí)，重組VvFrsA蛋白的催化活性最高。重組VvFrsA蛋白催化pNPB、pNPP水解的活性分別是催化pNPA水解活性的75%、22%?？梢?jiàn)，重組VvFrsA蛋白傾向于催化對(duì)硝基苯酚短鏈脂肪酸酯水解。

圖4 重組VvFrsA蛋白催化不同底物的相對(duì)活性

3 結(jié)論與討論

首個(gè)被報(bào)道的FrsA蛋白來(lái)自于大腸桿菌[9]。研究人員發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中FrsA蛋白以1∶1的比例特異性地結(jié)合去磷酸化的IIAGlc蛋白形成復(fù)合物，從而調(diào)控細(xì)胞中葡萄糖的發(fā)酵水平[9]。盡管FrsA蛋白在大腸桿菌中的生理功能已被闡明，然而FrsA蛋白的體外生化功能依然不清楚。

本研究將構(gòu)建的pET28a-VvFrsA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)了重組VvFrsA蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。通過(guò)Ni-NTA親和層析法一步純化得到純度較高的重組VvFrsA蛋白。

一般認(rèn)為，丙酮酸脫羧酶的催化活性依賴(lài)于TPP輔因子[15]。Lee等[10]研究表明，VvFrsA蛋白是一個(gè)不依賴(lài)TPP輔因子的丙酮酸脫羧酶。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)的對(duì)于丙酮酸脫羧酶的認(rèn)識(shí)。本研究以丙酮酸為反應(yīng)底物時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到VvFrsA在體外具有催化丙酮酸脫羧生成乙醛和二氧化碳的活性。進(jìn)一步的酶催化活性研究發(fā)現(xiàn)，VvFrsA蛋白是一個(gè)酯酶，可以催化對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯的水解，其最適底物是對(duì)硝基苯酚短鏈脂肪酸酯。這一發(fā)現(xiàn)與VvFrsA蛋白的晶體結(jié)構(gòu)特征及氨基酸序列比對(duì)結(jié)果相一致。研究表明，VvFrsA蛋白具有酯酶的催化三聯(lián)體[16-18]，并且pNPA可以在VvFrsA的活性中心穩(wěn)定存在長(zhǎng)達(dá)300 ns(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究結(jié)果為后續(xù)對(duì)重組VvFrsA蛋白進(jìn)行生化表征和對(duì)硝基苯酚乙酸酯水解的酶動(dòng)力學(xué)與催化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。