艾士奇，趙一全，孫志遠(yuǎn)，高亞梅，晏磊，唐鴻志，王偉東

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復(fù)合菌系降解纖維素過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

艾士奇1，趙一全1，孫志遠(yuǎn)1，高亞梅1，晏磊1，唐鴻志2，王偉東1

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319 2 上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

艾士奇, 趙一全, 孫志遠(yuǎn), 等. 復(fù)合菌系降解纖維素過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1794–1808.Ai SQ, Zhao YQ, Sun ZY, et al. Change of bacterial community structure during cellulose degradation by the microbial consortium. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1794–1808.

為明確高效纖維素降解復(fù)合菌系降解過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及關(guān)鍵的降解功能菌，利用該復(fù)合菌系對(duì)濾紙和稻稈進(jìn)行生物處理，通過底物降解、微生物生長(zhǎng)量、發(fā)酵液pH的變化情況，選擇不同降解時(shí)期復(fù)合菌系提取的總DNA進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序。通過分解特性試驗(yàn)確定在接種后培養(yǎng)第12、72、168 h分別作為降解初期、高峰期、末期。該復(fù)合菌系分別主要由1個(gè)門、2個(gè)綱、2個(gè)目、7個(gè)科、11個(gè)屬組成。隨著降解的進(jìn)行，短芽胞桿菌屬、喜熱菌屬的相對(duì)豐度逐漸降低；梭菌屬、芽胞桿菌屬、地芽胞桿菌屬、柯恩氏菌屬的相對(duì)豐度逐漸升高；解脲芽胞桿菌屬、泰氏菌屬、刺尾魚菌屬在降解高峰期時(shí)相對(duì)豐度最高；各時(shí)期類芽胞桿菌屬、瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度無(wú)明顯變化。上述11個(gè)主要菌屬均屬于厚壁菌門，具有嗜熱、耐熱、適應(yīng)廣泛pH、降解纖維素或半纖維素的特性。好氧型細(xì)菌是降解初期的主要優(yōu)勢(shì)功能菌，到中后期厭氧型細(xì)菌逐漸增多，并逐步取代好氧型細(xì)菌成為降解纖維素的主要細(xì)菌。

纖維素，復(fù)合菌系，降解，微生物多樣性

我國(guó)纖維素類生物質(zhì)資源豐富，但資源化利用程度低，近年來秸稈的焚燒、堆積等造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問題日益突出。纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物的生物降解和轉(zhuǎn)化利用與國(guó)家的能源、生態(tài)、環(huán)境和糧食安全問題密切相關(guān)。因此，纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用問題成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。利用生物法對(duì)纖維素進(jìn)行分解與生物轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)其資源化利用的有效途徑，而獲得能高效轉(zhuǎn)化纖維素資源的微生物是生物法利用的關(guān)鍵[2]。自20世紀(jì)以來，科研工作者們從自然環(huán)境中分離了多種纖維素降解能力較強(qiáng)的純培養(yǎng)菌株，包括真菌、細(xì)菌、放線菌等[3]。但是單一菌株并不符合自然界微生物協(xié)同降解作用這一普遍規(guī)律，實(shí)際應(yīng)用受到限制[4]。與此相比，利用限制性富集培養(yǎng)技術(shù)獲得的纖維素降解復(fù)合菌系，可以通過不同功能微生物之間的協(xié)作高效降解與轉(zhuǎn)化纖維素，具有廣闊的應(yīng)用前景[5]。Yuan等從堆肥中篩選出的復(fù)合菌系MC1培養(yǎng)3 d可降解88%的濾紙[6]；Wang等從高溫期堆肥中富集獲得的復(fù)合菌系培養(yǎng)10 d可降解99%的纖維素[7]，降解效率遠(yuǎn)高于同類復(fù)合菌系；Wang等從產(chǎn)沼氣旺盛的發(fā)酵罐中篩選的復(fù)合菌系BYND-8培養(yǎng)7 d可降解48.9%的稻稈[8]；鄧兵等從玉米秸稈還田地中篩選的常溫復(fù)合菌系可降解66.1%的玉米秸稈[9]。然而，由于復(fù)合菌系組成的復(fù)雜性、功能菌株的難分離培養(yǎng)等因素，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)限制了人們了解降解纖維素微生物群落的功能及其協(xié)同作用[10]，也影響了纖維素生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步提高。通過現(xiàn)代微生物組學(xué)的高通量測(cè)序技術(shù)，分析纖維素降解微生物群落組成及其降解過程中的演替規(guī)律，明確發(fā)揮降解功能的關(guān)鍵微生物，對(duì)充分了解不同功能微生物之間的協(xié)同作用具有重要意義。

本研究以高效、穩(wěn)定降解稻稈纖維素的復(fù)合菌系[7]為研究對(duì)象，該復(fù)合菌系是從牛糞堆肥高溫期通過限制性富集培養(yǎng)篩選獲得，經(jīng)前期試驗(yàn)驗(yàn)證，其經(jīng)傳代培養(yǎng)和保存后，菌種組成和功能均已達(dá)到穩(wěn)定；復(fù)合菌系具有較廣泛的初始pH耐受能力，在起始pH 5.0?9.0的范圍內(nèi)，纖維素降解能力極其穩(wěn)定，且較適宜生長(zhǎng)[11]。本研究利用16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序方法，分析復(fù)合菌系降解纖維素過程中各微生物分類單元的群落組成及其相對(duì)豐度變化，明確復(fù)合菌系群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，揭示復(fù)合菌系中關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)微生物及群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，為明確降解纖維素過程中微生物之間的協(xié)同作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)條件

利用蛋白胨纖維素 (PCS) 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分如下：蛋白胨5.0 g，纖維素 (濾紙和稻稈) 5.0 g (濾紙1 g、稻稈4 g)，NaCl 5.0 g，CaCO32.0 g，酵母粉1.0 g，溶解在1 L水中，pH自然。將培養(yǎng)基分裝至三角瓶中，裝液量為80% (體積比)，瓶中提前放入纖維素碳源，其中，濾紙貼壁放置，錫紙封口，1×105Pa、121 ℃滅菌15 min。接種量為10% (體積比)，50 ℃靜置培養(yǎng)。

稻稈的預(yù)處理方法如下：配制1%的NaOH溶液，把成熟的干稻稈剪成10 cm小段，放入容器中，使溶液覆蓋稻稈，浸泡24 h。流水沖洗數(shù)次，清水浸泡1?2 d，測(cè)定pH，用流水沖至中性，80 ℃烘干備用。以下不做特殊說明，試驗(yàn)所用稻稈均為堿處理的稻稈。

1.2 復(fù)合菌系降解纖維素 (稻稈、濾紙) 過程中總降解率及其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率的變化

利用失重法測(cè)定稻稈總降解率的變化。分別取培養(yǎng)第2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h復(fù)合菌系中的稻稈，每次取3個(gè)重復(fù)。將稻稈置于50 mL離心管中，7 000 r/min離心15 min，倒上清液，用鹽酸和硝酸的混合液沖洗以消除菌體，離心，用無(wú)菌水沖洗，離心，105 ℃烘干至恒重后稱重，計(jì)算稻稈的失重量和降解率[9]。烘干后的稻稈利用FIWE3/6纖維素測(cè)定儀 (意大利VELP) 測(cè)定其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量，并計(jì)算其降解率。

在培養(yǎng)過程中加入濾紙的目的是為了更直觀地反映復(fù)合菌系對(duì)纖維素的降解程度，對(duì)各時(shí)期的纖維素降解情況具有指示作用，利用肉眼觀察即可判斷纖維素是否被降解。在測(cè)定濾紙的總降解率時(shí)，將沒有分解的濾紙取出單獨(dú)烘干稱重，失重法計(jì)算其降解率。因?yàn)闉V紙的成分主要為纖維素，因此濾紙的減重即是其纖維素的分解量，沒有分別測(cè)定其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。

同時(shí)，設(shè)置一組空白對(duì)照，將已滅菌的培養(yǎng)基不接種復(fù)合菌系菌液而是加入等接種量的無(wú)菌水，放入50 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置，按照上述取樣時(shí)間觀察濾紙的變化情況，測(cè)定稻稈的失重量及其木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的失重量。

為了更真實(shí)觀察到不同降解時(shí)期稻稈表面形態(tài)的變化，分別取未經(jīng)生物處理、復(fù)合菌系處理第12、72、168 h的稻稈，將其剪成5 mm×5 mm的小條，用1%戊二醛4 ℃固定后，經(jīng)PBS沖洗，乙醇梯度脫水，叔丁醇置換，冷凍干燥儀 (德國(guó)CHRIST) 干燥后用導(dǎo)電膠帶粘在樣品臺(tái)上，用離子濺射儀 (日本HITACHI) 噴金，最后用低真空超高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 (美國(guó)NOVA) 觀察并拍照記錄。

1.3 復(fù)合菌系降解纖維素過程中生長(zhǎng)量的變化

利用雙光束紫外可見分光光度計(jì) (中國(guó)普析)600吸光值測(cè)定復(fù)合菌系生長(zhǎng)量的變化。分別在無(wú)菌條件下取適量的培養(yǎng)第0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h的復(fù)合菌系，置于比色杯中，每次測(cè)3個(gè)重復(fù)，繪制其生長(zhǎng)曲線。

1.4 復(fù)合菌系降解纖維素過程中培養(yǎng)體系pH的變化

利用微型pH計(jì) (日本HORIBA) 測(cè)定發(fā)酵液pH的變化。分別在無(wú)菌條件下取適量的培養(yǎng)第0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h的發(fā)酵液，每次測(cè)3個(gè)重復(fù)。

1.5 不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序

1.5.1 測(cè)序樣品的采集

在無(wú)菌條件下分別取纖維素降解初期、高峰期、末期，即培養(yǎng)12、72、168 h的復(fù)合菌系。取復(fù)合菌系培養(yǎng)液12 000 r/min離心10 min，獲得菌體，即復(fù)合菌系培養(yǎng)液中微生物樣品S1。

取復(fù)合菌系中的稻稈，置于新的三角瓶中，加入適量PBS，150?200 r/min振蕩30?60 min，超聲5 min，再振蕩，取上清液置于離心管中， 12 000 r/min離心10 min得菌體，即稻稈表面微生物樣品S2。

將S1與S2混合后作為測(cè)序樣品。

1.5.2 總DNA的提取及高通量測(cè)序

取適量樣品，利用改良的氯苯法提取總DNA[12]。經(jīng)Nanodrop及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇濃度大于10 ng/μL、總量超過500 ng、260/230超過1、260/280在1.8?2.2之間、瓊脂糖凝膠電泳主帶清晰的DNA。利用細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)引物515F (5′-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3′) 和909R (5′-CCCCGYCAATTCMTTT RAGT-3′) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量。利用Illumina MiSeq測(cè)序儀對(duì)構(gòu)建合格的文庫(kù)進(jìn)行PE250測(cè)序，測(cè)序工作在四川博貝特生物科技有限公司完成。

1.5.3 生物信息學(xué)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理：使用軟件FLASh V1.2.7對(duì)每個(gè)樣品的兩端測(cè)序序列進(jìn)行拼接，得到原始序列。利用軟件Qiime V1.9.0將原始序列過濾處理得到高質(zhì)量序列。利用軟件Usearch v8.0檢測(cè)嵌合體序列，去除后得到有效序列。

OTU聚類：利用軟件Qiime的cd-hit方法對(duì)所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%相似性將序列聚類成為OTU，同時(shí)選取OTU的代表序列。并去除OTU中的Singleton (在所有樣品中只有1條序列的OTU)。

物種注釋：利用軟件RDP Classifier Version 2.2對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種注釋分析，設(shè)定閾值為0.8。

均一化處理：對(duì)OTU表中各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。后續(xù)的Alpha多樣性和Beta多樣性分析都是基于均一化處理的數(shù)據(jù)。

圖1 復(fù)合菌系對(duì)濾紙的降解

圖2 復(fù)合菌系降解稻稈過程中總降解率及其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率的變化

Alpha多樣性分析：利用軟件Qiime Version 1.9.0對(duì)Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson等多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，用Origin8.5軟件繪制稀釋曲線。

Beta多樣性分析：根據(jù)OTU表和系統(tǒng)發(fā)育樹生成加權(quán)的Unifrac距離矩陣，繪制主坐標(biāo)分析 (PCoA) 圖。使用R軟件以聚類熱圖 (Heatmap) 的形式展現(xiàn)各樣品物種相對(duì)豐度分布的相似程度。

冗余分析 (RDA)：根據(jù)復(fù)合菌系不同降解時(shí)期纖維素、半纖維素含量的測(cè)定結(jié)果，結(jié)合不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Canoco 5.0軟件對(duì)其進(jìn)行冗余分析，探究復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)變化與纖維素降解的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系降解纖維素 (稻稈、濾紙) 過程中總降解率及其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率的變化

復(fù)合菌系降解稻稈過程中，稻稈總降解率及其木質(zhì)素、纖維素、半纖維素降解率的變化均呈先升高最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì) (圖1、圖2)。稻稈由12 h開始降解，但此時(shí)的降解率非常低，稻稈總降解率為11%，稻稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別為0%、7.81%和0.69%，此時(shí)培養(yǎng)基中的濾紙也未降解 (圖1)。在第48?72 h內(nèi)稻稈的降解率迅速上升，降解效率最快。到第72 h時(shí)濾紙完全降解，稻稈的降解率達(dá)51.75%，此時(shí)稻稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別為21.62%、35.13%和35.93%。在第168?192 h，稻稈降解趨于穩(wěn)定，最終降解率達(dá)到85.25%，稻稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別為50.90%、92.14%和73.81%，復(fù)合菌系具有強(qiáng)大的降解木質(zhì)纖維素的能力。

不同降解時(shí)期稻稈在微觀下的降解形態(tài)如圖3所示。圖中依次是未經(jīng)復(fù)合菌系處理以及復(fù)合菌系處理12、72、168 h的放大2 000倍的稻稈表面電鏡照片。表面致密的稻稈隨著復(fù)合菌系培養(yǎng)的進(jìn)行，維管束纖維逐漸大面積被降解，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，稻稈表面的完整結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，最難降解的外表皮上的蠟質(zhì)硅化層大部分降解消失，只剩下部分嚴(yán)重木質(zhì)化的表皮組織。

圖3 復(fù)合菌系降解稻稈過程中稻稈表面的形態(tài)變化

結(jié)合以上結(jié)果，本研究選擇第12、72、168 h分別代表復(fù)合菌系降解纖維素初期、高峰期、末期，且這3個(gè)時(shí)期稻稈總降解率及其中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素降解率差異顯著 (<0.05)。而我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組在不接種復(fù)合菌系菌液的情況下，濾紙、稻稈均未發(fā)生降解。

2.2 復(fù)合菌系降解纖維素過程中生長(zhǎng)量和培養(yǎng)體系pH的變化

從圖4A可以看出，復(fù)合菌系生長(zhǎng)量的變化趨勢(shì)是隨著培養(yǎng)的進(jìn)行先迅速升高，達(dá)到最高值后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，較好地反映出了微生物生長(zhǎng)曲線中的指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。在培養(yǎng)的前96 h里，復(fù)合菌系的生長(zhǎng)量迅速上升，由接種初期的0.016增加到0.611，在這段時(shí)間內(nèi)纖維素也被快速降解。在培養(yǎng)96?168 h里，復(fù)合菌系的生長(zhǎng)量達(dá)到頂峰，進(jìn)入暫時(shí)的平穩(wěn)階段。從第168 h開始，復(fù)合菌系的生長(zhǎng)量呈下降，而此時(shí)稻稈降解也基本結(jié)束，進(jìn)入了降解末期。到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，復(fù)合菌系的生長(zhǎng)量降到0.472。結(jié)合以上結(jié)果，上述3個(gè)時(shí)期復(fù)合菌系均在指數(shù)期與穩(wěn)定期階段，其代謝活性高，進(jìn)而保證了后續(xù)16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序DNA量的充足。

從圖4B可以看出，復(fù)合菌系發(fā)酵液的pH總體呈先下降后上升最后趨于中性的趨勢(shì)。接種后培養(yǎng)液的初始pH為8.2，在培養(yǎng)的前48 h，發(fā)酵液的pH明顯下降，到第48?120 h維持最低值6.4左右，降解高峰期也在此階段內(nèi)。隨著纖維素降解的逐漸完成，從第120 h開始，發(fā)酵液的pH開始回升，呈持續(xù)升高的趨勢(shì)。直到培養(yǎng)末期的第240 h，發(fā)酵液的pH回升至中性水平為7.0，經(jīng)后續(xù)測(cè)定一直維持這一中性水平。發(fā)酵液pH的變化與纖維素降解產(chǎn)物有機(jī)酸的含量息息相關(guān)，從降解初期開始，由于纖維素降解產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，使得發(fā)酵液pH迅速下降。隨著降解的進(jìn)行，發(fā)酵液中有機(jī)酸大量積累，直到降解高峰期時(shí)發(fā)酵液pH降到最低。但積累的有機(jī)酸由于培養(yǎng)基中CaCO3的中和作用未使發(fā)酵液pH一直降低，維持在弱酸水平。到降解后期，隨著纖維素降解的逐漸完成，有機(jī)酸積累相對(duì)減少，同時(shí)復(fù)合菌系中會(huì)存在一些以有機(jī)酸為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)菌，使得發(fā)酵液的pH才逐漸恢復(fù)。復(fù)合菌系在降解纖維素時(shí)具有自我調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系pH的能力，這種能力解除了有機(jī)酸對(duì)纖維素降解菌的阻遏作用，體現(xiàn)了復(fù)合菌系降解纖維素的優(yōu)勢(shì)所在。

2.3 不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的微生物組成及其相對(duì)豐度變化

對(duì)不同降解時(shí)期復(fù)合菌系質(zhì)量合格的總DNA進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序，測(cè)序得到的下機(jī)原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、質(zhì)量過濾、去除嵌合體等得到有效數(shù)據(jù)，其基本數(shù)據(jù)信息如表1所示。3個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量在10 Mb以上，序列的平均長(zhǎng)度在425?426 bp之間，GC含量在54%左右。說明測(cè)序深度合理，可用于后續(xù)物種分析。已將該測(cè)序序列數(shù)據(jù)提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù) (Accession No. SRP125468)。

對(duì)不同降解時(shí)期復(fù)合菌系總DNA進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序，基于測(cè)序的有效數(shù)據(jù)，將其微生物群落組成按照數(shù)據(jù)庫(kù)中已知、可分類的微生物分別在門、綱、目、科、屬5個(gè)分類水平上給出物種注釋，并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)細(xì)菌的相對(duì)豐度。

在微生物門的分類水平上，復(fù)合菌系包含11個(gè)門的細(xì)菌。按照在任意一個(gè)樣品中相對(duì)豐度超過1.00%的細(xì)菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以下4個(gè)分類水平如不作特殊說明，均按照這種統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)。從圖5A可以發(fā)現(xiàn)，不同降解時(shí)期的復(fù)合菌系基本上由厚壁菌門Firmicutes組成，其相對(duì)豐度均占據(jù)99%以上。

在微生物綱的分類水平上，復(fù)合菌系包含16個(gè)綱的細(xì)菌。不同降解時(shí)期的復(fù)合菌系主要由芽胞桿菌綱Bacilli和梭菌綱Clostridia組成 (圖5B)。從培養(yǎng)12 h起，隨著纖維素降解的進(jìn)行，芽胞桿菌綱的相對(duì)豐度逐漸降低，由降解初期的57.08%降低到末期的23.14%；梭菌綱的相對(duì)豐度逐漸升高，由降解初期的42.24%升高到末期的76.07%。

在微生物目的分類水平上，復(fù)合菌系包含28個(gè)目的細(xì)菌。不同降解時(shí)期的復(fù)合菌系主要由芽胞桿菌目Bacillales和梭菌目Clostridiales組成 (圖5C)。從培養(yǎng)12 h起，隨著纖維素降解的進(jìn)行，芽胞桿菌目的相對(duì)豐度逐漸降低，由降解初期的57.08%降低到末期的23.12%；梭菌目的相對(duì)豐度逐漸升高，由降解初期的42.21%升高到末期的75.76%。

在微生物科的分類水平上，復(fù)合菌系包含48個(gè)科的細(xì)菌。不同降解時(shí)期的復(fù)合菌系主要由類芽胞桿菌科Paenibacillaceae、梭菌科Clostridiaceae、動(dòng)球菌科Planococcaceae、芽胞桿菌科Bacillaceae、梭菌目第11家族未定地位的菌科Clostridiales Family XI. Incertae Sedis、疣微菌科Ruminococcaceae、消化球菌科Peptococcaceae組成 (圖5D)。從培養(yǎng)12 h起，隨著纖維素降解的進(jìn)行，類芽胞桿菌科的相對(duì)豐度逐漸降低，由降解初期的46.39%降低到末期的8.11%；梭菌科 (39.18%?70.80%)、芽胞桿菌科 (2.16%?11.77%) 的相對(duì)豐度由降解初期到末期逐漸升高；動(dòng)球菌科、梭菌目第九家族未定地位菌科、消化球菌科在降解高峰期時(shí)的相對(duì)豐度高于其他2個(gè)時(shí)期，其在降解高峰期的相對(duì)豐度分別為16.24%、5.53%、1.42%；疣微菌科在3個(gè)時(shí)期的相對(duì)豐度無(wú)明顯變化，其相對(duì)豐度在1.06%?1.27%之間。

表1 3個(gè)測(cè)序樣品有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與微生物組成的Alpha多樣性指數(shù)

The sample FHJ1, FHJ2 and FHJ3 represented consortium in initial stage, peak stage and end stage of degradation respectively. The sequencing depth was 20 653 sequences per sample.

在微生物屬的分類水平上，復(fù)合菌系包含103個(gè)屬的細(xì)菌。與其他4個(gè)微生物分類水平相比，復(fù)合菌系的群落組成在屬的分類水平上比較豐富。不同降解時(shí)期的復(fù)合菌系主要由短芽胞桿菌屬、梭菌屬、解脲芽胞桿菌屬、喜熱菌屬、芽胞桿菌屬、泰氏菌屬、類芽胞桿菌屬、瘤胃球菌屬、刺尾魚菌屬、地芽胞桿菌屬、柯恩氏菌屬組成 (圖5E)。從培養(yǎng)12 h起，隨著纖維素降解的進(jìn)行，短芽胞桿菌屬 (45.10%?6.01%)、喜熱菌屬 (3.10%?0.36%) 的相對(duì)豐度由降解初期到末期逐漸降低；梭菌屬 (39.18%?70.80%)、芽胞桿菌屬 (2.16%?11.77%)、地芽胞桿菌屬 (0.12%?4.53%)、柯恩氏菌屬 (0.07%?1.85%) 的相對(duì)豐度由降解初期到末期逐漸升高；解脲芽胞桿菌屬、泰氏菌屬、刺尾魚菌屬在降解高峰期時(shí)的相對(duì)豐度高于其他2個(gè)時(shí)期，其相對(duì)豐度分別為15.60%、5.21%、4.79%；類芽胞桿菌屬 (1.09%?0.22%)、瘤胃球菌屬 (0.91%?1.07%) 在3個(gè)時(shí)期的相對(duì)豐度無(wú)明顯變化。同時(shí)，在微生物屬的分類水平上，對(duì)不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的物種組成相對(duì)豐度進(jìn)行聚類分析，如圖5F所示。降解高峰期與末期的復(fù)合菌系聚類在一起，說明它們?cè)谖锓N組成的相對(duì)豐度分布上相似程度更大，而具體的主要優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度變化與圖5E一致。

2.4 不同降解時(shí)期復(fù)合菌系組成的Alpha與Beta多樣性分析

對(duì)不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序所獲得的OTU表經(jīng)過隨機(jī)重抽樣后進(jìn)行Alpha多樣性分析。如表1所示，3個(gè)樣品的測(cè)序飽和度均在99%以上，說明測(cè)序數(shù)據(jù)基本覆蓋樣品中的物種，降解高峰期時(shí)的復(fù)合菌系較其他2個(gè)時(shí)期相比，所觀察到的OTU數(shù)最多，Chao1指數(shù)最高，Simpson、PD whole tree多樣性指數(shù)也最大。即在降解高峰期時(shí)，復(fù)合菌系的微生物組成多樣性最豐富。

對(duì)不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序所獲得的OTU表經(jīng)過隨機(jī)重抽樣后進(jìn)行Beta多樣性分析，主要進(jìn)行了基于加權(quán)Unifrac距離的主坐標(biāo)分析 (PCoA)，如圖6所示。在第一主坐標(biāo)解釋95.35%的群落差異、第二主坐標(biāo)解釋4.65%的群落差異的情況下，3個(gè)樣品之間存在一定的距離，說明不同降解時(shí)期復(fù)合菌系在物種組成、相對(duì)豐度、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有一定的差異。

2.5 復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)與纖維素降解的關(guān)系

將不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的主要屬水平上的細(xì)菌與不同降解時(shí)期纖維素、半纖維素含量的變化進(jìn)行冗余分析，如圖7與表2所示。不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)與纖維素降解相關(guān)環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)為1，第1排序軸變化量為0.664 6，第2排序軸變化量為0.335 4，說明排序軸能較好地反映不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)同纖維素降解相關(guān)環(huán)境因子的相關(guān)性，進(jìn)而說明纖維素的降解直接影響了復(fù)合菌系微生物群落結(jié)構(gòu)的變化 (表2)。

圖6 不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的PCoA圖

不同降解時(shí)期的3個(gè)樣品分別分布在3個(gè)象限上，3個(gè)樣品之間存在一定的距離，說明不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的微生物群落結(jié)構(gòu)具有差異，這也與Beta多樣性結(jié)果一致 (圖7)。其中，、、依次分布在降解初期樣品所在象限，說明在降解初期復(fù)合菌系中主要以這些細(xì)菌存在并發(fā)揮降解功能。而、、、依次主要分布在降解高峰期樣品所在象限，且這些細(xì)菌的相對(duì)豐度在此時(shí)期最高，說明它們?cè)诮到飧叻迤诎l(fā)揮了一定降解功能。、、、依次相對(duì)集中在降解末期樣品所在位置，同時(shí)、、、射線分別與纖維素、半纖維素射線呈銳角，且夾角較小、射線長(zhǎng)度大體相同，因此呈較強(qiáng)的正相關(guān)性，即在復(fù)合菌系降解纖維素的過程中，纖維素、半纖維素含量對(duì)上述4種細(xì)菌的影響作用最大，反過來說明在復(fù)合菌系中這4種細(xì)菌對(duì)纖維素的降解貢獻(xiàn)度最大。

圖7 不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的群落結(jié)構(gòu)與纖維素降解的RDA圖

表2 不同降解時(shí)期復(fù)合菌系的群落結(jié)構(gòu)與纖維素降解的RDA結(jié)果

3 討論

本研究所用的纖維素降解復(fù)合菌系與其他同類復(fù)合菌系相比，其在短時(shí)間內(nèi)對(duì)天然纖維素材料的降解率更高，華彬彬[13]從牛糞堆肥樣品中篩選的復(fù)合菌系在50 ℃靜置培養(yǎng)結(jié)束后僅降解50%左右的稻稈。而本研究的復(fù)合菌系在相同培養(yǎng)條件下可降解80%以上的稻稈，降解效果優(yōu)越。

不同降解時(shí)期的復(fù)合菌系主要由厚壁菌門的細(xì)菌組成。在自然界中，厚壁菌門的細(xì)菌在纖維素降解中起重要作用[14]，且能適應(yīng)極端pH，具有耐熱特性[15]，這一點(diǎn)也說明了復(fù)合菌系在高溫、pH劇烈浮動(dòng)的培養(yǎng)條件下仍能發(fā)揮降解功能。另一方面也說明在人為創(chuàng)造的纖維素降解的非自然微生態(tài)環(huán)境中，厚壁菌門應(yīng)該占主要地位[16]。

在屬水平上，隨著纖維素的不斷降解，復(fù)合菌系中的細(xì)菌主要有3種變化趨勢(shì)。第1種趨勢(shì)是復(fù)合菌系中短芽胞桿菌屬、喜熱菌屬的相對(duì)豐度逐漸降低。尤其短芽胞桿菌屬在降解初期占了近一半的比例，但到中后期失去了優(yōu)勢(shì)地位。馮紅梅等[17]從堆肥高溫期樣品中分離出高效降解纖維素的高溫短芽胞桿菌。該屬絕大多數(shù)嚴(yán)格好氧，可利用糖類產(chǎn)酸[18]。說明短芽胞桿菌屬在復(fù)合菌系培養(yǎng)初期降解纖維素發(fā)揮了巨大的作用，也導(dǎo)致了有機(jī)酸的大量積累，使得從培養(yǎng)開始pH一直下降，直到高峰期時(shí)pH最低。但是，該復(fù)合菌系的呼吸類型屬微好氧型，初期培養(yǎng)體系內(nèi)氧氣充足適宜它的生長(zhǎng)，當(dāng)氧氣被消耗掉，到降解的中后期它的相對(duì)豐度自然就降低了。李瑩等[19]重新組配該復(fù)合菌系的單菌，通過克隆文庫(kù)的方法同樣發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)初期短芽胞桿菌屬占主要地位，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，它的比例持續(xù)下降。其次，復(fù)合菌系中喜熱菌屬僅在降解初期相對(duì)豐度較大，Zhang等[20]從纖維素降解復(fù)合菌系RXS分離到高溫纖維素、半纖維素降解菌，屬于喜熱菌，說明該屬對(duì)于初期纖維素的降解起了一定的作用。

第2種趨勢(shì)是梭菌屬等厭氧、兼性菌的相對(duì)豐度逐漸升高。梭菌屬的相對(duì)豐度從降解開始就很高，占35.06%，這與接種都選擇在降解后期有關(guān)，因?yàn)榈浇到夂笃谒缶鷮僬嫉?0%以上，本底水平就很高；另一方面也說明梭菌屬?gòu)氖贾两K對(duì)纖維素的降解發(fā)揮著不可替代的作用[21]，尤其在降解的高峰期與后期，是該復(fù)合菌系降解纖維素的關(guān)鍵菌。溫雪等[22]通過常規(guī)分離方法驗(yàn)證了梭菌屬是該復(fù)合菌系的核心功能菌。李瑩等[19]也驗(yàn)證了在該復(fù)合菌系中梭菌屬的比例隨著培養(yǎng)的進(jìn)行持續(xù)增加，到末期占主導(dǎo)地位。這也說明復(fù)合菌系的好氧菌在降解初期消耗掉大部分氧氣，進(jìn)而像梭菌屬這一類的厭氧菌大量生長(zhǎng)[3]，相對(duì)豐度升高。同時(shí)，梭菌屬可發(fā)酵有機(jī)酸[21]，而像短芽胞桿菌屬、解脲芽胞桿菌屬、芽胞桿菌屬等這類產(chǎn)酸菌的相對(duì)豐度已經(jīng)遠(yuǎn)不及梭菌屬的高，這也是在降解高峰期過后pH回升的原因之一。在復(fù)合菌系中，芽胞桿菌屬、地芽胞桿菌屬、柯恩氏菌屬的相對(duì)豐度也逐漸升高。雖然后三者的相對(duì)豐度遠(yuǎn)不及梭菌屬升高的明顯，但是能降解纖維素、半纖維素的它們?cè)诮到庵泻笃谏鎇23-25]，與梭菌屬一起對(duì)中后期的降解起一定作用。

第3種趨勢(shì)是解脲芽胞桿菌屬、泰氏菌屬、刺尾魚菌屬高峰期時(shí)相對(duì)豐度最高。Ting等[26]從堆肥及熱泉中分離出了嚴(yán)格好氧、嗜熱、釋放木聚糖酶與纖維素酶的解脲芽胞桿菌，能發(fā)酵木糖、葡萄糖、甘露糖等小分子糖[27]。說明在降解初期纖維素降解產(chǎn)生的糖產(chǎn)物可被解脲芽胞桿菌屬利用，進(jìn)而相對(duì)豐度升高；然而到降解末期培養(yǎng)體系缺氧，它的相對(duì)豐度自然又降低了。劉震東等[28]利用DGGE法也發(fā)現(xiàn)解脲芽胞桿菌屬在復(fù)合菌系纖維素降解中期時(shí)為優(yōu)勢(shì)菌群，而在末期數(shù)量極少。此外，在復(fù)合菌系中泰氏菌屬[29]、刺尾魚菌屬[30]同樣具有纖維素水解作用。高峰期時(shí)復(fù)合菌系對(duì)纖維素的轉(zhuǎn)化率高，而它們?cè)诖穗A段相對(duì)豐度最高，說明它們?cè)诟叻迤跁r(shí)降解活性最強(qiáng)。

另外，復(fù)合菌系中類芽胞桿菌屬、瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度在纖維素降解過程中無(wú)明顯變化，僅占整體水平的1%左右。但它們也具有降解纖維素或半纖維素的能力[31-32]，然而它們的相對(duì)豐度在各降解時(shí)期均無(wú)明顯變化，可能它們?cè)趶?fù)合菌系里發(fā)揮的作用不及其他細(xì)菌明顯。

通過對(duì)不同降解時(shí)期復(fù)合菌系微生物組成的Alpha、Beta多樣性分析發(fā)現(xiàn)，盡管3個(gè)時(shí)期的主要微生物組成相同，但是整體的群落結(jié)構(gòu)還是有一定差異的，降解高峰期時(shí)微生物組成多樣性最豐富。可能因?yàn)閺?fù)合菌系本身微生物組成多樣性豐富，只是在培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基中能利用的碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，某些主要利用纖維素降解產(chǎn)物的細(xì)菌不足以生長(zhǎng)繁殖；隨著纖維素的降解，產(chǎn)生了可溶的營(yíng)養(yǎng)代謝產(chǎn)物，這些細(xì)菌得以生存繁殖，細(xì)菌多樣性增加；但纖維素降解完全后，營(yíng)養(yǎng)已被耗盡，某些菌體死亡，又減少了微生物群落的多樣性。

4 結(jié)論

本研究的復(fù)合菌系是由好氧型細(xì)菌、兼性厭氧型細(xì)菌、嚴(yán)格厭氧型細(xì)菌組成的復(fù)雜微生物群體，在降解纖維素的過程中其微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。降解初期好氧菌在群落中處于數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)地位，厭氧菌次之；從降解高峰期開始到降解末期，厭氧菌、兼性菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌，占主導(dǎo)地位。正是因?yàn)閺?fù)合菌系有著豐富的微生物多樣性以及多樣性的不斷交替變化，復(fù)合菌系中微生物在降解纖維素過程中協(xié)同作用，使得它有強(qiáng)大的纖維素降解能力。

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Change of bacterial community structure during cellulose degradation by the microbial consortium

Shiqi Ai1, Yiquan Zhao1, Zhiyuan Sun1, Yamei Gao1, Lei Yan1, Hongzhi Tang2, and Weidong Wang1

1 Heilongjiang Provincial Engineering Technology Research Center of Straws Resources Utilization, Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Environmental Microbiology and Recycling of Agro-Waste in Cold Region, College of Life Science and Biotechnology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang, China 2 State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

In order to clarify dynamic change of microbial community composition and to identify key functional bacteria in the cellulose degradation consortium, we studied several aspects of the biodegradation of filter papers and rice straws by the microbial consortium, the change of substrate degradation, microbial biomass and pH of fermentation broth. We extracted total DNA of the microbial consortium in different degradation stages for high-throughput sequencing of amplicons of bacterial 16 S rRNA genes. Based on the decomposition characteristics test, we defined the 12th, 72nd and 168th hours after inoculation as the initial stage, peak stage and end stage of degradation, respectively. The microbial consortium was mainly composed of 1 phylum, 2 classes, 2 orders, 7 families and 11 genera. With cellulose degradation, bacteria in the consortium showed different growth trends. The relative abundance ofanddecreased gradually. The relative abundance of,,andincreased gradually. The relative abundance of,,was the highest in peak stage. The relative abundance ofanddid not change obviously in each stage. Above-mentioned 11 main genera all belonged to Firmicutes, which are thermophilic, broad pH adaptable and cellulose or hemicellulose degradable. During cellulose degradation by the microbial consortium, aerobic bacteria were dominant functional bacteria in the initial stage. However, the relative abundance of anaerobic bacteria increased gradually in middle and end stage, and replaced aerobic bacteria to become main bacteria to degrade cellulose.

cellulose, consortium, degradation, microbial diversity

February 11, 2018;

April 23, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31270536), Special Program for Local Science and Technology Development Guided by Central Government (No. ZY16A06-02), Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, China (No. 2D2018005), Open Foundation of Heilongjiang Provincial Key Laboratory (No. 201703), Program of Graduate Innovation and Research of Heilongjiang Bayi Agricultural University (No. YJSCX2017-Y70).

Weidong Wang. Tel/Fax: +86-459-6819298; E-mail: wwdcyy@126.com

Hongzhi Tang. Tel/Fax: +86-21-34206723;E-mail:tanghongzhi@sjtu.edu.cn

10.13345/j.cjb.180061

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31270536)，中央財(cái)政引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng) (No. ZY16A06-02)，黑龍江省自然科學(xué)基金 (No. 2D2018005)，黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金 (No. 201703)，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目 (No. YJSCX2017-Y70) 資助。

2018-11-01

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181030.1521.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)