王毳，劉葉，鞏旭，劉龍,2，康振,2

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構(gòu)建葡萄糖二酸指示系統(tǒng)篩選肌醇加氧酶突變株

王毳1，劉葉1，鞏旭1，劉龍1,2，康振1,2

1 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

王毳, 劉葉, 鞏旭, 等. 構(gòu)建葡萄糖二酸指示系統(tǒng)篩選肌醇加氧酶突變株. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1772–1783.Wang C, Liu Y, Gong X, et al. Construction of a glucaric acid biosensor for screening myo-inositol oxygenase variants. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1772–1783.

葡萄糖二酸是一種高附加值天然有機(jī)酸，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病防治、生產(chǎn)聚合物材料等領(lǐng)域。在葡萄糖二酸的合成途徑中，肌醇加氧酶MIOX所催化的肌醇轉(zhuǎn)換為葡萄糖醛酸的過程是整個(gè)途徑的限速步驟。通過應(yīng)用將葡萄糖二酸濃度與綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度相結(jié)合的篩選系統(tǒng)，從突變體文庫(kù)中篩選出3株有潛力的肌醇加氧酶突變體（K59V/R60A、R171S 和D276A），使MIOX活性得到提高。重組菌株BL21(DE3)/MU-R171S的葡萄糖二酸產(chǎn)量相比于未突變菌株提高了36.5%。

葡萄糖二酸，肌醇加氧酶，生物傳感器，高通量篩選

葡萄糖二酸在一些水果、蔬菜及哺乳動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)，特別是在一些十字花科蔬菜 (如花椰菜、苜蓿芽等)、水果 (櫻桃、葡萄柚、柑橘等) 中含量豐富[1]。葡萄糖二酸與其衍生物早在1996年就已被證實(shí)在疾病防治方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值，包括降低膽固醇[2]、用于癌癥化療，并能以葡萄糖二酸鈣的形式作為一種膳食補(bǔ)充劑[3-4]。葡萄糖二酸已成功用于生產(chǎn)一種羥基化的尼龍，產(chǎn)生可降解的纖維[5]。眾多附加應(yīng)用使得葡萄糖二酸在2004年被美國(guó)能源部確認(rèn)為“最具價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品”之一[6]。

葡萄糖二酸的生產(chǎn)主要依賴使用硝酸為氧化劑的葡萄糖化學(xué)氧化法[7]，該方法存在耗費(fèi)大量試劑、污染環(huán)境等問題，故國(guó)內(nèi)外研究人員紛紛尋求通過生物法生產(chǎn)該物質(zhì)。Prather團(tuán)隊(duì)通過在大腸桿菌中異源表達(dá)途徑酶肌醇加氧酶MIOX和醛酸脫氫酶Udh，成功構(gòu)建了葡萄糖二酸合成途徑，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖二酸在中的生物合成[8](圖1)。隨后該團(tuán)隊(duì)研究人員將該葡萄糖二酸合成途徑轉(zhuǎn)移至釀酒酵母中，使以葡萄糖為底物的產(chǎn)量提高至0.98 g/L[9]。Liu等以畢赤酵母為宿主構(gòu)建葡萄糖二酸合成途徑，通過添加肌醇使產(chǎn)量達(dá)到 (6.61±0.30) g/L[10]。Lee等通過構(gòu)建環(huán)形支架聚合木聚糖內(nèi)切酶Xyn、α-葡萄糖醛酸酶AG和醛酸脫氫酶Udh，提高了半纖維素水解率并氧化獲得葡萄糖二酸[11]。

在重組葡萄糖二酸合成途徑中，葡萄糖首先通過磷酸烯醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase) 形成葡萄糖-6-磷酸，之后葡萄糖-6-磷酸通過肌醇-1-磷酸合成酶 (Inositol-1-phosphate synthase，Ino1) 的作用異構(gòu)化為肌醇-1-磷酸。在脫磷酸酶 (Inositol monophosphate 1-phosphatase) 水解作用下肌醇-1-磷酸脫去磷酸基團(tuán)生成肌醇。肌醇通過來自小鼠的肌醇氧化酶 (-inositol oxygenase，MIOX) 和來自丁香假單胞菌的醛酸脫氫酶 (Udh) 的催化氧化生成葡萄糖二酸。此外，中存在葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的代謝途徑，基因編碼的糖醛酸異構(gòu)酶 (Glucuronate isomerase) 催化葡萄糖醛酸生成果糖醛酸，果糖醛酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化后進(jìn)入磷酸戊糖途徑；基因編碼的葡萄糖二酸脫水酶 (Glucarate dehydratase) 催化葡萄糖二酸生成5-脫氫-4-脫氧-D-葡萄糖二酸，進(jìn)一步反應(yīng)進(jìn)入二羧酸代謝途徑。

圖1 重組E. coli葡萄糖二酸合成途徑[8]

葡萄糖二酸的人工合成途徑中，催化肌醇轉(zhuǎn)換為葡萄糖醛酸的MIOX的活性與Ino1和Udh相比較低，同時(shí)穩(wěn)定性差[12]、容易失活，發(fā)酵培養(yǎng)過程中只在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期具有較高活性，進(jìn)入穩(wěn)定期后活性迅速降低[8]，故MIOX所催化的反應(yīng)被認(rèn)為是二酸合成途徑中的限速步驟。研究人員采取了一些策略來提高代謝通量：Dueber等利用合成支架將Ino1、MIOX和Udh按比例裝配成聚合體，強(qiáng)化前體肌醇的合成，提高了葡萄糖二酸的產(chǎn)量[13]；Shiue等在MIOX的N端添加蛋白融合標(biāo)簽提高其水溶性[14]；Liu等使用連接肽將MIOX和Udh進(jìn)行融合表達(dá)，提高M(jìn)IOX的比酶活[10]。目前，這些改造策略都能提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量，但對(duì)MIOX的活力及穩(wěn)定性提高有限，依然無法滿足應(yīng)用要求，因此，通過蛋白質(zhì)工程策略，構(gòu)建突變體文庫(kù)，通過大規(guī)模篩選獲得最佳的MIOX突變體對(duì)于提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量具有很大意義。

MIOX酶活力的檢測(cè)需要菌體裂解制備酶液，與底物反應(yīng)后進(jìn)行地衣酚顯色測(cè)670 nm吸光度。這一過程操作繁瑣、耗時(shí)且具有破壞性[8]。研究結(jié)果表明提高M(jìn)IOX酶活力可提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量，應(yīng)用不同來源的MIOX時(shí)葡萄糖二酸的產(chǎn)量也不同，可通過葡萄糖二酸的產(chǎn)量來反映MIOX突變體的酶活力[15-16]。常用的葡萄糖二酸含量檢測(cè)方法是利用硼酸凝膠結(jié)合葡萄糖二酸，與發(fā)酵液中的雜質(zhì)分離后用高效液相色譜檢測(cè)[8]，該方法操作也較復(fù)雜，且硼酸凝膠價(jià)格昂貴，不適用于大規(guī)模篩選。若能將胞內(nèi)代謝物與相應(yīng)傳感器和報(bào)告基因進(jìn)行偶聯(lián)，使胞內(nèi)代謝物濃度轉(zhuǎn)化為便于檢測(cè)的熒光信號(hào)，就可對(duì)胞內(nèi)代謝物濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[16]。每個(gè)細(xì)胞以正比于其生產(chǎn)特定化合物的速度表達(dá)熒光蛋白或抗生素抗性基因，就可通過內(nèi)部代謝物濃度和報(bào)告基因表達(dá)之間的聯(lián)系來篩選最理想的細(xì)胞[17]，從而縮短設(shè)計(jì)-構(gòu)建- 檢測(cè)的周期。與之相比，已有的多數(shù)誘導(dǎo)系統(tǒng)缺乏對(duì)感應(yīng)速度和程度的表征而只能以0或1的形式運(yùn)作，產(chǎn)生的信息足以用于過表達(dá)潛在的毒性基因，卻無法用于探測(cè)細(xì)胞行為、精確控制基因表達(dá)[18]。

熒光檢測(cè)方法可利用已知的變構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白響應(yīng)一些常見的代謝中間體，如丙酮酸[19]、磷酸烯醇丙酮酸[20]、檸檬酸鹽[21]、乳酸[22]、不飽和脂肪酸[23]等。通過小分子傳感器的選擇或篩選，已經(jīng)產(chǎn)生了新的酶和基因組來提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[24-27]。已得到良好表征并應(yīng)用較廣泛的傳感器有LacI[28]、TetR[29]、AraC[30]、LuxR[31]等，其他可用的有PrpR[32]、RhaRS[33]、CymR[34]、XylS[35]、AcuR[36]、CdaR、MphR[37]、TtgR[38-39]等。

其中CdaR (Carbohydrate diacid regulator) 是一種來自的轉(zhuǎn)錄激活因子，參與調(diào)節(jié)葡萄糖二酸和粘酸分解代謝酶的表達(dá)。這些酶的編碼基因分布于3個(gè)轉(zhuǎn)錄單元中，包括葡萄糖二酸脫水酶、粘酸脫水酶、5-酮-4-脫氧-D-葡糖二酸醛縮酶、羥基丙二酸半醛還原酶和己糖二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[40]。對(duì)不同碳源存在下的葡萄糖二酸脫水酶、粘酸脫水酶、甘油酸激酶和羥基丙二酸半醛還原酶的活性分析發(fā)現(xiàn)葡萄糖二酸和粘酸代謝系統(tǒng)受協(xié)同調(diào)節(jié)。通過對(duì)MC4100進(jìn)行甲基磺酸乙酯突變和藍(lán)白斑篩選、測(cè)序，最終在3個(gè)轉(zhuǎn)錄單元之外找到了葡萄糖二酸和粘酸代謝的共同調(diào)節(jié)基因——[41]。對(duì)其進(jìn)行Tn5插入失活會(huì)損傷對(duì)葡萄糖二酸、粘酸和甘油酸的代謝[42]，此外計(jì)算機(jī)分析顯示該基因產(chǎn)物是具有保守螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白，可與其他基因調(diào)節(jié)蛋白如XylR[43]被歸為一類?；蚓幋a的是非活性的變構(gòu)轉(zhuǎn)錄激活蛋白，受葡萄糖二酸、粘酸或甘油酸激活后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问剑Y(jié)合到啟動(dòng)子的調(diào)控序列后發(fā)揮變構(gòu)調(diào)節(jié)作用，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。

據(jù)此，本研究以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，在中構(gòu)建響應(yīng)葡萄糖二酸的指示系統(tǒng)，測(cè)試誘導(dǎo)物濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，并構(gòu)建葡萄糖二酸合成途徑，將葡萄糖二酸指示系統(tǒng)應(yīng)用于對(duì)mMIOX突變體的高通量篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

本研究所用菌株和質(zhì)粒均為作者所在實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買和保藏，詳見表1。

表1 本研究所用質(zhì)粒和菌株

1.1.2 試劑

PrimerSTAR Max DNA聚合酶、DNA marker、Solution I、Competent Cell Preparation Kit均購(gòu)自TaKaRa (大連)；2×PCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、GeneJET Gel Extraction Kit及GeneJET PCR Purification Kit購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；PCR引物 (見表2) 由上海睿迪有限公司合成；SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自上海Sangon有限公司；易錯(cuò)PCR試劑盒購(gòu)自Agilent Technologies有限公司。肌醇、葡萄糖二酸鉀色譜級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥控股有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 基因的擴(kuò)增和質(zhì)粒的構(gòu)建

以MG1655基因組為模板，利用引物對(duì)p23119-CdaR-F/R擴(kuò)增得到帶有啟動(dòng)子P23119的調(diào)節(jié)蛋白基因，用引物gudP-F和gudP-R擴(kuò)增啟動(dòng)子序列。以pHTC-為模板，用引物gfp-F和gfp-R擴(kuò)增基因。將擴(kuò)增得到的片段和進(jìn)行融合PCR，得到融合片段-，使用限制性酶切位點(diǎn)Ⅰ和Ⅰ對(duì)其進(jìn)行雙酶切，連接到具有相應(yīng)切口的質(zhì)粒pRSFDuet-1上，連接后得到質(zhì)粒pRSFDuet--。使用限制性酶切位點(diǎn)Ⅰ和Ⅰ對(duì)片段進(jìn)行雙酶切，連接到具有相應(yīng)切口的質(zhì)粒pRSFDuet--上，連接后的質(zhì)粒命名為pRSFDuet-P-cdaR。

以從惡臭假單胞菌KT2440中提取的基因組DNA為模板，用引物對(duì)Udh-F/R擴(kuò)增得到基因，將此片段使用限制性酶切位點(diǎn)Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，連接到具有響應(yīng)切口的質(zhì)粒pETDuet-1上，連接后得到質(zhì)粒pETDuet-U；以pUC57-mM質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)MIOX-F/R擴(kuò)增得到小鼠來源的基因，將該片段使用限制性酶切位點(diǎn)Ⅰ和d Ⅲ進(jìn)行雙酶切，連接到具有相應(yīng)切口的質(zhì)粒pETDuet-U上，連接后得到質(zhì)粒pETDuet-mM-U。

表2 本研究中所用引物序列

1.2.2.的轉(zhuǎn)化

感受態(tài)制備參見Competent Cell Preparation Kit (TaKaRa大連) 使用說明書。

1.2.3 突變MIOX和篩選

以pUC57-mM質(zhì)粒為模板，使用引物對(duì)Mut-MIOX-F/R對(duì)進(jìn)行易錯(cuò)PCR，將得到的片段使用限制性酶切位點(diǎn)Ⅰ和d Ⅲ 進(jìn)行雙酶切，連接到具有相應(yīng)切口的質(zhì)粒pETDuet-U上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)/ P-cdaR后，挑選單菌落接種到每孔帶有 200 μL LB液體培養(yǎng)基的96淺孔板中，以未突變的BL21 (DE3)/PcdaR-MU為對(duì)照，37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)后，以10%接種量 (/) 轉(zhuǎn)接到含有IPTG的96孔板LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，篩選熒光較強(qiáng)的突變株。

1.2.4 MIOX酶活的測(cè)定

以肌醇作為底物，根據(jù)MIOX轉(zhuǎn)化肌醇生成葡萄糖醛酸的含量，檢測(cè)MIOX的催化活性。MIOX單位酶活定義：1 min內(nèi)生成1 nmol/L葡萄糖醛酸所需要的酶量。取樣將發(fā)酵液離心棄上清 (5 000 r/min、4 ℃、5 min)，用Tris-Cl緩沖液 (10 mmol/L，pH 8.0) 清洗2遍菌體以消除發(fā)酵液中雜質(zhì)的影響，將菌體重懸在清洗緩沖液中，同時(shí)加入等體積1.0 mm硅珠，采用FastPrep-24均質(zhì)破碎儀破碎，破壁后離心取上清100 μL至1.5 mL EP管內(nèi)，加入900 μL反應(yīng)液，立即放入30 ℃恒溫金屬浴中反應(yīng)1 h，加入100 μL的30%三氯乙酸終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)液1 mL加入玻璃比色管內(nèi)，然后加入2 mL苔黑素試劑，混勻后，在沸水中反應(yīng)15 min。當(dāng)反應(yīng)物冷卻至室溫時(shí)，在670 nm下測(cè)量吸光度。

葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配置濃度為4、8、12、16、20、24 mg/L的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及苔黑素試劑 (在10 mL的濃鹽酸中加入40 mg苔黑素和5.4 mg FeCl3)。在玻璃比色管內(nèi)加入1 mL的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及2 mL苔黑素試劑，混勻后，在沸水中反應(yīng)15 min。當(dāng)反應(yīng)物冷卻至室溫時(shí)，在670 nm下測(cè)量吸光度。以葡萄糖醛酸的濃度作為軸，以測(cè)得的670 nm的吸光度作為軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將以含有肌醇反應(yīng)液的吸光度減去不含肌醇反應(yīng)液的吸光度，得到的差值根據(jù)葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出葡萄糖醛酸的含量，從而計(jì)算MIOX酶活。

底物反應(yīng)液：含有50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、2 mmol/L L-半胱氨酸、1 mmol/L Fe(NH4)2(SO4)2和10 g/L肌醇。以不添加肌醇的反應(yīng)液作為對(duì)照。

1.2.5 葡萄糖二酸的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備：稱取一定質(zhì)量的葡萄糖二酸鉀標(biāo)樣，溶于0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液中，配置終濃度為1 g/L的葡萄糖二酸溶液，將其用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液稀釋，配置終濃度分別為0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 g/L的葡萄糖二酸溶液。

樣品的Affi-Gel凝膠處理：取1 mL發(fā)酵液在12 000 r/min下離心5 min。取0.9 mL發(fā)酵液上清或葡萄糖二酸溶液加入2 mL EP管內(nèi)，然后加入0.1 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液及50 mg Affi-Gel，漩渦振蕩5次，每次停20 min (室溫下)，然后將樣品5 000 r/min 離心5 min，棄上清。用1 mL 80 mmol/L磷酸鉀-20 mmol/L硼酸緩沖液 (pH 7.0) 加入到沉淀中，漩渦振蕩，離心棄上清 (重復(fù)3次)。用0.375 mL 0.1 mol/L HCI洗脫2次，混合離心，將上清轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，用1 mol/L NaOH調(diào)中性 (75 μL)，加去離子水 (75 μL) 補(bǔ)足到0.9 mL。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供液相分析[8]。

HPLC分析條件：流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸，色譜柱為Aminex HPX-87H (美國(guó)Bio-Rad)，流速0.5 mL/min，柱溫55℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器 (210 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖二酸指示系統(tǒng)的構(gòu)建

2.1.1 葡萄糖二酸指示系統(tǒng)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

MG1655來源的編碼非活性激活蛋白，被葡萄糖二酸激活后結(jié)合到啟動(dòng)子調(diào)控序列，開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄 (圖2)。本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒應(yīng)用啟動(dòng)子P23119使得基因得以組成型表達(dá)。培養(yǎng)基中的葡萄糖二酸經(jīng)酶轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)后激活CdaR使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问剑M(jìn)而與操縱子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，即本研究中作為報(bào)告基因的。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，命名為pRSFDuet-PcdaR (圖3)。

圖2 葡萄糖二酸指示系統(tǒng)示意圖

圖3 葡萄糖二酸指示系統(tǒng)重組質(zhì)粒pRSFDuet-Pgfp-cdaR圖譜

將帶有該指示系統(tǒng)質(zhì)粒的菌株BL21 (DE3)/PcdaR在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以菌株BL21 (DE3)/pRSFDuet-1和BL21 (DE3)/gudP-為對(duì)照，加入葡萄糖二酸進(jìn)行誘導(dǎo)后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示，只有同時(shí)具有調(diào)節(jié)蛋白基因和受其調(diào)控的啟動(dòng)子序列的菌株BL21 (DE3)/PcdaR可以在葡萄糖二酸的誘導(dǎo)下產(chǎn)生熒光，表明該指示系統(tǒng)成功構(gòu)建。在培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)肌醇和葡萄糖醛酸，與不添加葡萄糖二酸的對(duì)照都沒有觀察到熒光反應(yīng)，驗(yàn)證了調(diào)節(jié)蛋白CdaR在該途徑中結(jié)合葡萄糖二酸的專一性。

2.1.2 葡萄糖二酸濃度與熒光反應(yīng)強(qiáng)度關(guān)系的測(cè)定

為了研究該指示系統(tǒng)響應(yīng)葡萄糖二酸的濃度范圍，在BL21 (DE3)/PcdaR培養(yǎng)基中加入了梯度濃度的葡萄糖二酸進(jìn)行誘導(dǎo)。用酶標(biāo)儀測(cè)定了熒光值和600 nm吸光度，歸一化熒光值由實(shí)驗(yàn)測(cè)得的熒光值除以吸光度所得，應(yīng)用此比值以補(bǔ)償時(shí)間和批次之間細(xì)胞密度差異。使用12 h時(shí)的歸一化熒光值來反映誘導(dǎo)物葡萄糖二酸濃度與熒光反應(yīng)強(qiáng)度之間的關(guān)系，結(jié)果如圖5A所示，在0–600 mg/L濃度范圍內(nèi)，綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度與所加的葡萄糖二酸濃度之間呈良好的線性關(guān)系，在600–4 000 mg/L濃度范圍內(nèi) (圖5B)，熒光反應(yīng)強(qiáng)度繼續(xù)隨著葡萄糖二酸濃度的增加而增強(qiáng)，外加葡萄糖二酸響應(yīng)的上限約為4 000 mg/L (19.1 mmol/L)，葡萄糖二酸濃度達(dá)到4 000 mg/L以上時(shí)影響菌體生長(zhǎng)。

2.2 葡萄糖二酸合成途徑的構(gòu)建

為了方便對(duì)突變肌醇加氧酶MIOX進(jìn)行篩選，首先需要在BL21 (DE3) 中構(gòu)建以肌醇為底物的葡萄糖二酸合成途徑。構(gòu)建表達(dá)載體pETDuet-mM-U，以T7啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)小鼠來源的肌醇加氧酶 (MIOX) 和惡臭假單胞菌來源的醛酸脫氫酶 (Udh)，如圖6所示，并進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證。

圖4 不同菌株對(duì)葡萄糖二酸的熒光響應(yīng)

圖5 葡萄糖二酸指示系統(tǒng)的熒光分析

圖6 葡萄糖二酸合成途徑重組質(zhì)粒圖譜

將重組菌株BL21 (DE3)/P-cdaR-MU接種至液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，10%接種量 (/) 轉(zhuǎn)接至含有肌醇的LB培養(yǎng)基中 (以不添加肌醇為對(duì)照)，加IPTG后30℃、220 r/min培養(yǎng)，24 h取發(fā)酵液上清進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè)，結(jié)果見圖7，在發(fā)酵液中檢出葡萄糖二酸峰，表明重組菌株中催化肌醇生產(chǎn)葡萄糖二酸的途徑構(gòu)建成功。IPTG誘導(dǎo)后每3 h取樣，用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光和600，菌株BL21 (DE3)/P-cdaR-MU添加肌醇的熒光值明顯高于未添加肌醇的對(duì)照(圖8)，表明該菌株中MIOX和Udh實(shí)現(xiàn)活性表達(dá)，并與葡萄糖二酸指示系統(tǒng)成功偶聯(lián)，使重組中葡萄糖二酸的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)。

2.3 MIOX突變體的篩選

使用易錯(cuò)PCR對(duì)MIOX進(jìn)行突變，初篩時(shí)使用Qpix挑菌機(jī)將突變體接種到96孔板中過夜培養(yǎng)，以10%接種量轉(zhuǎn)接到含有肌醇的LB液體培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，篩選熒光較強(qiáng)的突變株。初篩從3 900株菌中得到7株，經(jīng)測(cè)序后分別為：K59V/R60A、K70E、R171S、Q180V、N205F、P269E、D276A。以未突變菌株BL21 (DE3)/PcdaR-MU作為對(duì)照，將初篩得到的菌株采用地衣酚顯色法測(cè)酶活進(jìn)行復(fù)篩，得到突變體K59V/R60A、R171S、D276A，它們與野生型的酶活分別為 (43.17±1.68) U/mL、(54.14±1.02) U/mL、(40.25±1.24) U/mL、(34.71± 0.89) U/mL (圖9)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明MIOX與其突變體的表達(dá)量無明顯差異 (圖10)。因此，MIOX突變體酶活的增加可能歸因于其比活力的提高。

圖7 葡萄糖二酸標(biāo)準(zhǔn)品和重組E. coli發(fā)酵液上清的質(zhì)譜檢測(cè)

圖8 E. coli BL21 (DE3)/Pgfp-cdaR-MU的熒光分析(肌醇10 g/L)

圖9 MIOX突變體的酶活及熒光響應(yīng)

圖10 SDS-PAGE分析MIOX的表達(dá)

由于突變體庫(kù)初篩時(shí)采用的是96孔板與搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩在體積、溶氧等參數(shù)方面存在較大的差異，導(dǎo)致初篩獲得的突變體在兩種不同體系下表現(xiàn)出不同的性狀。最終，我們選擇在初篩和復(fù)篩中都表現(xiàn)較好的突變體K59V/R60A、R171S、D276A開展進(jìn)一步的研究。

2.4 MIOX突變體對(duì)葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響

將上述突變位點(diǎn)K59V/R60A、R171S、D276A引入BL21 (DE3)/MU，得到菌株BL21 (DE3)/MU-K59V/R60A、BL21 (DE3) /MU-R171S和BL21 (DE3)/MU-D276A，在含有肌醇的LB培養(yǎng)基中IPTG誘導(dǎo)48 h后葡萄糖二酸產(chǎn)量如圖11所示，依次為 (126.69±8.66) mg/L、(172.97±6.08) mg/L、(146.39±6.39) mg/L、(134.65± 8.07) mg/L，提高程度與酶活相近，從而進(jìn)一步證明MIOX酶活力的提高有助于提高重組菌葡萄糖二酸的產(chǎn)量。

圖11 MIOX突變對(duì)重組E. coli BL21 (DE3)葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響

3 結(jié)語

本研究構(gòu)建了葡萄糖二酸指示系統(tǒng)，通過結(jié)合綠色熒光蛋白和識(shí)別葡萄糖二酸的變構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白CdaR，將重組中葡萄糖二酸的生產(chǎn)與熒光信號(hào)偶聯(lián)起來。驗(yàn)證了該指示系統(tǒng)與外加的葡萄糖二酸濃度間存在良好的線性關(guān)系，并將其應(yīng)用于肌醇加氧酶MIOX突變體文庫(kù)的高通量篩選，得到3株具有潛力的突變體，經(jīng)測(cè)序分別為K59V/R60A、R171S和D276A，其中R171S酶活提升最顯著，將其應(yīng)用于重組中，使葡萄糖二酸的產(chǎn)量提高了36.5%。本研究結(jié)果同時(shí)說明MIOX在轉(zhuǎn)化肌醇生成葡萄糖二酸的過程中起著重要作用。在前體物質(zhì)肌醇的合成途徑中肌醇- 1-磷酸合成酶 (Ino1) 也是重要的限速酶，為進(jìn)一步提高葡萄糖二酸產(chǎn)量，同時(shí)降低生產(chǎn)成本，下一步研究可在中表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶基因，構(gòu)建從葡萄糖到葡萄糖二酸的合成途徑，應(yīng)用葡萄糖二酸指示系統(tǒng)對(duì)肌醇-1-磷酸合成酶突變體進(jìn)行篩選，同時(shí)可抑制或敲除各支路代謝途徑酶 (如糖醛酸異構(gòu)酶、葡萄糖二酸脫水酶等，圖1)，以減少中間產(chǎn)物的消耗，進(jìn)而增加葡萄糖二酸的積累。

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Construction of a glucaric acid biosensor for screening-inositol oxygenase variants

Cui Wang1, Ye Liu1, Xu Gong1, Long Liu1,2, and Zhen Kang1,2

1Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Glucaric acid (GA), a top value-added chemical from biomass, has been widely used for prevention and control of diseases and the production of polymer materials. In GA biosynthesis pathway, the conversion of inositol to glucuronic acid that catalyzed by-inositol oxygenase is the limiting step. It is necessary to improve MIOX activity. In the present study, we constructed a high-throughput screening system through combing the concentration of GA with the green fluorescent protein fluorescence intensity. By applying this screening system, three positive variants (K59V/R60A, R171S and D276A) were screened from the mutant library. In comparison, the recombinant strainBL21(DE3)/MU-R171S accumulated more GA, 136.5% of that of the parent strain.

glucaric acid,-inositol oxygenase, biosensor, high-throughput screening

February 7, 2018;

April 25, 2018

The National First-class Discipline Program of Light Industry Technology and Engineering (No. LITE2018-16), the Program for Chang Jiang Scholar and Innovative Research Team in University (No. IRT_15R26).

Zhen Kang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: zkang@jiangnan.edu.cn

Long Liu. Tel: +86-510-85918312; Fax: +86-510-85918309; E-mail:longliu@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.180056

輕工技術(shù)與工程國(guó)家一流學(xué)科項(xiàng)目 (No. LITE2018-16)，長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃 (No. IRT_15R26)資助。

2018-05-14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180511.1550.002.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)