何崔同，張瑤，姜穎，徐平

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小蛋白質(zhì)富集法鑒定釀酒酵母“漏檢蛋白”

何崔同1,2，張瑤2,3，姜穎1,2，徐平1,2

1 安徽醫(yī)科大學，安徽 合肥 230032 2 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所 蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室 國家蛋白質(zhì)科學中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206 3 中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275

何崔同, 張瑤, 姜穎, 等. 小蛋白質(zhì)富集法鑒定釀酒酵母“漏檢蛋白”. 生物工程學報, 2018, 34(11): 1860–1869.He CT, Zhang Y, Jiang Y, et al. Identification of missing proteins in Saccharomyces cerevisiae bysmall protein-based enrichment. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1860–1869.

小蛋白質(zhì) (Small proteins，SPs) 是由小開放閱讀框 (Short open reading frames，sORFs) 編碼長度小于100個氨基酸的多肽。研究發(fā)現(xiàn)小蛋白質(zhì)參與了基因表達調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導和代謝等重要生物學過程。然而，生命體中大多數(shù)的已注釋小蛋白質(zhì)尚缺少蛋白水平存在的實驗證據(jù)，被稱為漏檢蛋白 (Missing proteins，MPs)。小蛋白質(zhì)的高效鑒定是其功能研究的前提，也有助于挖掘“漏檢蛋白”。文中采用小蛋白質(zhì)富集策略鑒定到72個酵母小蛋白質(zhì)，驗證9個“漏檢蛋白”，發(fā)現(xiàn)低分子量、高疏水性、膜結(jié)合、弱密碼子使用偏性及不穩(wěn)定性是蛋白漏檢的主要原因，對進一步的技術優(yōu)化具有指導意義。

蛋白質(zhì)組學，小蛋白質(zhì)，富集，漏檢蛋白

小蛋白質(zhì) (Small proteins，SPs) 是由小開放閱讀框 (Short open reading frames，sORFs) 編碼長度小于100個氨基酸 (Amino acid，AA) 的多肽。小蛋白質(zhì)在多數(shù)生命過程中發(fā)揮著重要的 作用，如蛋白互作與酶活性調(diào)節(jié)[1]、細胞信號 轉(zhuǎn)導和細胞間通訊[2]，以及基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]等。

然而，據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫所示，目前幾乎所有生命體中大多數(shù)已注釋小蛋白質(zhì)尚缺少蛋白水平存在的實驗證據(jù)和相關功能研究，這類蛋白質(zhì)被稱為漏檢蛋白 (Missing proteins，MPs)。UniProt數(shù)據(jù)庫將所有已注釋蛋白質(zhì)存在證據(jù) (Protein existence，PE) 分為5個水平，從PE1 (蛋白質(zhì)水平實驗證據(jù)) 到PE5 (無任何證據(jù))，其中漏檢蛋白被定義為PE2 (轉(zhuǎn)錄組水平的實驗證據(jù))、PE3 (依據(jù)序列同源性推斷的證據(jù)) 和PE4 (基于基因預測得到的證據(jù))[4]。漏檢蛋白研究在2012年已被人類染色體蛋白質(zhì)組計劃 (Chromosome-centric Human Proteome Project，C-HPP) 列為主要任務之一[5]，但在其他生命體中尚未探及。

小蛋白質(zhì)的有效鑒定是功能研究的前提，小蛋白質(zhì)鑒定技術的發(fā)展不僅有助于從蛋白質(zhì)水平驗證漏檢蛋白，而且為進一步漏檢蛋白功能研究提供了技術手段。與基于熒光蛋白[6]和親和富集標簽[7]的生化方法相比，基于質(zhì)譜鑒定的技術可以在蛋白質(zhì)組水平高通量準確鑒定蛋白質(zhì)且可以避免標簽的引入對小蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的可能干擾[8]。小蛋白質(zhì)的低豐度以及復雜體系中高豐度大蛋白質(zhì)的信號掩蓋是造成小蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定困難的最直接原因[9]。

本研究以釀酒酵母為研究對象，采用小蛋白質(zhì)富集策略來提高小蛋白質(zhì)覆蓋度。最終，我們共鑒定到72個小蛋白質(zhì)，并成功驗證9個漏檢蛋白(Q02820、A5Z2X5、Q2V2P4、P38127、P40086、P40086、Q3E762、Q8TGU7、Q2V2P2)。小蛋白質(zhì)和漏檢蛋白特殊理化、生物學性質(zhì)及其質(zhì)譜鑒定規(guī)律的揭示對小蛋白質(zhì)和漏檢蛋白鑒定技術的進一步優(yōu)化具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母JMP024[10]為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖 (Dextrose)、尿素 (Urea)、碳酸氫銨(NH4HCO3) 均為購自國藥集團化學試劑有限公司的分析純試劑；酵母粉 (Yeast extract)、蛋白胨 (Bacto-peptone) 均購自OXOID公司；疊氮鈉(NaN3)、二硫蘇糖醇 (Dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺 (Iodoacetamide，IAA) 均購自AMRESCO公司；2-巰基乙醇 (β-mercaptoethanol，β-ME)、聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)、甲酸(Formic acid，F(xiàn)A)、色譜級乙腈 (Acetonitrile，ACN)均購自Sigma-Aldrich公司；質(zhì)譜級胰蛋白酶(Trypsin) 為實驗室自制試劑[11-12]。

1.1.3 主要儀器

LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超高壓納升級高效液相色譜儀(Ultra-high Performance Liquid Chromatography) 為Waters公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將JMP024接種于YPD培養(yǎng)基 (1%酵母粉，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖) 中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期 (600=1.5)，離心并收集菌體，0.01% 疊氮鈉洗滌菌體后于–80 ℃保存。

1.2.2 小蛋白質(zhì)富集和蛋白質(zhì)組樣品制備

向上述收集的62(41.3 mL) 菌體中加入適量的裂解液Ⅰ (0.05 mol/L鹽酸，0.1% 2-巰基乙醇，0.05%聚乙二醇辛基苯基醚)[9]，玻璃珠渦旋振蕩破碎 (工作30 s，冰浴30 s，10個循環(huán))。細胞裂解后4 ℃、17 000×離心20 min，收集沉淀。沉淀用裂解液Ⅰ洗滌3次，離心取沉淀。將上述沉淀重懸于適量裂解液Ⅱ (8 mol/L尿素，0.05 mol/L 碳酸氫銨，0.005 mol/L碘乙酰胺)[13]，4 ℃、17 000×離心20 min，收集上清。采用Xu灰度定量法[14]進行蛋白質(zhì)定量。取80 μg蛋白于PCR管中，加入1 mol/L二硫蘇糖醇至終濃度0.005 mol/L，45 ℃溫浴30 min。加0.5 mol/L碘乙酰胺至終濃度0.01 mol/L，室溫避光孵育30 min。還原、烷基化后的蛋白樣品采用12% Tricine-SDS- PAGE短膠分離。待樣品入分離膠3 cm時停止 電泳。再經(jīng)考馬斯亮藍G250染色、脫色后，將 0–3.4 kDa、3.4–5 kDa和5–10 kDa的膠條分別切下，將膠條均分為1 mm3膠粒，然后進行脫色、干燥。所得膠粒使用胰酶過夜酶解后，抽提肽段，蒸干后置于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LC-MS/MS分析

消化肽段樣品用毛細管 (75 μm i.d.×15 cm，Beijing SpectraPeaks) 反相低pH分離，毛細管填料為C18 (100 ?，3 μm，Michron Bioresources InC)。分離流速為0.3 μL/min，梯度設置為2%–4% B，6 min；4%–10% B，2 min；10%–25% B，27 min；25%–35% B，20 min；35%–80%，5 min (流動相A，0.1%甲酸和2%乙腈；流動相B，0.1%甲酸和100%乙腈)。洗脫組分經(jīng)納升級電噴霧離子源接口噴出，進入LTQ Orbitrap Velos分析。質(zhì)譜采用一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描模式 (Data dependent MS/MS scan) 碰撞誘導裂解 (CID) 模式碎裂一級離子。一級質(zhì)譜掃描范圍 (300–1 600)，分辨率設置為30 000；自動增益控制 (Automatic gain control，AGC) 為106。依次選取一級信號強度最高的20個離子進行二級碎裂分析，碰撞歸一化能量 (NCE) 為35%；AGC為104；最大離子注入時間為30 ms；動態(tài)排除為40 s。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫搜索與MPs鑒定

Maxquant (version 1.5.6.0) 對質(zhì)譜產(chǎn)出的數(shù)據(jù)文件 (.raw) 進行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索。數(shù)據(jù)庫為從UniProt下載的釀酒酵母S288C蛋白序列數(shù)據(jù)庫 (Version: 201711)。搜庫參數(shù)如下：1) 胰酶特異性酶切；2) 固定修飾為半胱氨酸的烷基化修飾 (+57.021 46 Da)；3) 可變修飾為甲硫氨酸氧化修飾（+15.994 92 Da）；4) 母離子質(zhì)量誤差20 ppm；5) 子離子質(zhì)量誤差0.5 Da；6) 允許最大漏切位點數(shù)目為2個；7) 肽段長度≥7 AA；8) 肽段最大修飾為2種。搜庫結(jié)果采用目標-誘餌庫策略進行過濾，并設定肽段和蛋白質(zhì)鑒定FDR均小于1%。MPs的篩選標準包括以下幾點：1) 至少1條長度≥10 AA的唯一肽段；2) 譜圖具有高信噪比且所有b/y離子基本都要能匹配上；3) 譜圖主峰被匹配；4) 等重序列過濾，評估是否存在I=L，Q[去酰胺基]=E，GG=N。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母漏檢蛋白集中分布于低分子量區(qū)

據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫記錄，釀酒酵母中有707個蛋白質(zhì)屬于漏檢蛋白，占總注釋蛋白的10.5%，這些漏檢蛋白主要分布在低分子量區(qū) (圖1A)。釀酒酵母中小蛋白質(zhì)數(shù)為509個，其中漏檢蛋白所占比例接近30% (圖1B)。除此之外，人、結(jié)核分枝桿菌、擬南芥中漏檢蛋白在小蛋白質(zhì)中比例相仿，這些漏檢蛋白分布特征暗示我們可以通過小蛋白質(zhì)特殊富集策略來挖掘漏檢蛋白。因此我們采用12% Tricine-SDS-PAGE來分離、富集釀酒酵母小蛋白質(zhì)。

2.2 富集法鑒定72個小蛋白質(zhì)

我們共鑒定到697個蛋白質(zhì) (1 960個唯一肽段)，其中小蛋白質(zhì)72個，占酵母已注釋PE1小蛋白質(zhì)的35%，其中47個蛋白鑒定到兩條及兩條以上唯一肽段 (表1)。小蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)集中最大類群屬于核糖體蛋白家族，共鑒定到15個亞基。其中40S鑒定小蛋白數(shù)占該類群注釋小蛋白的70%，60S鑒定小蛋白占該類群注釋小蛋白的54.5%。小蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)集中還鑒定到其他類群蛋白，如細胞色素家族、轉(zhuǎn)運蛋白、ATP合成酶亞基家族、U6 snRNA相關蛋白等。

2.3 鑒定小蛋白質(zhì)特征

相對高分子量：已鑒定小蛋白質(zhì)長度主要在61–100 AA間 (圖2A)。盡管已注釋小蛋白質(zhì)中1–60 AA蛋白數(shù)最多，但實際鑒定數(shù)最少，這反映了即使在使用小蛋白質(zhì)鑒定技術的條件下依然存在著向更長蛋白的偏倚。

高比例親水性蛋白：與已注釋小蛋白質(zhì)相比，72個鑒定小蛋白質(zhì)中疏水蛋白比例要低很多，尤其在1–60 AA蛋白類群中疏水比例差別最大 (圖2B)?？傄炎⑨屝〉鞍踪|(zhì)中，疏水蛋白占43%，1–60 AA中疏水蛋白比例高達52.8%。然而，在我們鑒定小蛋白質(zhì)中，親水蛋白占主體，比例高達82%。短的相對于長的蛋白的更強疏水傾向特性是造成小蛋白質(zhì)鑒定向更長蛋白偏倚的一個重要原因。

細胞分布差異不顯著：亞細胞定位分析 (圖2C) 顯示，鑒定小蛋白質(zhì)主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)，且二者蛋白數(shù)目幾乎相當。而已注釋小蛋白質(zhì)中絕大多數(shù)都定位于細胞膜，與前面描述的高疏水性特征相一致。傳統(tǒng)的蛋白提取通常以完整細胞為研究對象，針對膜蛋白的提取策略可能會提高小蛋白質(zhì)覆蓋度。

弱密碼子使用偏性：密碼子適應指數(shù) (Codon adaptation index，CAI) 反映編碼區(qū)同義密碼子與密碼子最佳使用相符合的程度，取值范圍在0–1之間。CAI值越高表明更強密碼子使用偏性和更高表達水平[15]。已注釋小蛋白質(zhì)編碼基因的CAI值在整體上最低 (圖2D)，表明小蛋白質(zhì)的表達水平可能要低于蛋白質(zhì)組整體表達水平。鑒定小蛋白質(zhì)比已注釋小蛋白質(zhì)對應基因的CAI值要高，意味著我們鑒定到的小蛋白質(zhì)是已注釋小蛋白質(zhì)中相對高表達的部分。密碼子使用偏性被普遍認為受蛋白編碼基因長度的影響，在大腸桿菌等細胞中，密碼子使用偏性與蛋白編碼基因長度呈顯著正相關。Eyre-Walker猜測這是由于進化產(chǎn)生的選擇壓力以避免翻譯過程中錯誤的引入[16]?；诮湍感〉鞍踪|(zhì)整體弱密碼子使用偏性的特征優(yōu)化其表達條件可能會促進小蛋白質(zhì)的表達和鑒定。

圖1 釀酒酵母漏檢蛋白分布特征

表1 富集法鑒定到72個小蛋白質(zhì)

圖2 鑒定小蛋白質(zhì)特征分析

不穩(wěn)定性：蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù) (Instability index) 可用來評估蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。該參數(shù)低于40的蛋白質(zhì)被認為是穩(wěn)定蛋白，而高于40則被認為不穩(wěn)定，不穩(wěn)定蛋白往往半衰期較短[17]。我們發(fā)現(xiàn)一半以上的小蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。與已注釋小蛋白質(zhì)相比，鑒定小蛋白質(zhì)在高穩(wěn)定性蛋白質(zhì)區(qū)域的比例相對較低且整體呈現(xiàn)向中、低穩(wěn)定性蛋白質(zhì)區(qū)域的偏倚 (圖2E)，這意味著不穩(wěn)定性是小蛋白質(zhì)的另一重要特征。

KEGG分析 (圖2F) 表明已鑒定小蛋白質(zhì)主要是核糖體和剪接體的組成成分，且主要參與了氧化磷酸化的細胞通路，表明這些小蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)翻譯和能量代謝方面發(fā)揮重要功能。

2.4 小蛋白質(zhì)富集促進漏檢蛋白鑒定

在小蛋白質(zhì)富集數(shù)據(jù)集中我們共鑒定到13個漏檢蛋白，經(jīng)嚴格譜圖質(zhì)量篩選后 (圖3E)，最終保留了9個漏檢蛋白，它們均僅有一條唯一肽段。驗證的漏檢蛋白中，包括5個PE3 (Q02820、A5Z2X5、Q2V2P4、P38127、P40086) 和4個PE4 (Q2V2P9、Q3E762、Q8TGU7、Q2V2P2) 蛋白質(zhì) (圖3A)。可信漏檢蛋白中7個蛋白質(zhì) (Q02820、A5Z2X5、P38127、P40086、Q2V2P9、Q8TGU7、Q8TGU7) 定位于膜上，5個屬于單跨膜漏檢蛋白，2個線粒體內(nèi)在膜蛋白質(zhì) (P38127和P40086)多次跨膜，分別跨膜6次和7次。這提示我們 可以借鑒膜蛋白富集策略進一步實現(xiàn)MPs高效鑒定。

可信漏檢蛋白中，5個漏檢蛋白屬于功能未知蛋白；Q02820可能參與非經(jīng)典蛋白輸出通路[18]；2個線粒體內(nèi)在膜蛋白可能參與能量轉(zhuǎn)換途徑[19]，即P38127 (Mitochondrial carrier protein RIM2) 和P40086 (Cytochrome c oxidase assembly protein COX15)；A5Z2X5屬于UPF0495家族蛋白；Q2V2P4屬于功能未知蛋白，位于Ⅸ染色體上，由73 AA組成，其中1–22 AA屬于信號肽區(qū)，成熟區(qū)是23–73 AA區(qū)。

圖3 小蛋白質(zhì)富集促進漏檢蛋白鑒定

漏檢蛋白中78%的蛋白質(zhì)屬于小蛋白質(zhì)(圖 2B)，表明小蛋白質(zhì)富集策略有助于挖掘漏檢蛋白。鑒定漏檢蛋白中一半屬于親水蛋白，疏水蛋白鑒定效率的提高可能有助于漏檢蛋白的鑒定。

已注釋PE1蛋白、已注釋漏檢蛋白和鑒定漏檢蛋白編碼基因CAI分布比較分析表明，已注釋漏檢蛋白對應基因的CAI在整體上要顯著低于已注釋PE1蛋白，這說明漏檢蛋白的表達水平要低于PE1蛋白。此外，與已注釋漏檢蛋白相比，鑒定漏檢蛋白相應基因的CAI在整體上向高CAI區(qū)偏移，這表明我們鑒定到的漏檢蛋白是已注釋漏檢蛋白中相對高表達的部分(圖 2C)。弱密碼子使用偏性可能是造成其相應蛋白難以檢測的深層次原因。

已注釋漏檢蛋白中57%的蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，而在鑒定漏檢蛋白中不穩(wěn)定蛋白僅占33% (圖 2D)。這說明高比例不穩(wěn)定蛋白是漏檢蛋白整體的一個重要特征，其可能不利于漏檢蛋白的鑒定。提高蛋白穩(wěn)定性的方法可能有助于進一步鑒定漏檢蛋白。

3 討論

盡管成千上萬蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能已被系統(tǒng)研究，小蛋白質(zhì)的生物學研究卻被極大地忽視了。這主要是由于小蛋白質(zhì)的高效鑒定是蛋白質(zhì)組學領域的技術難題。我們通過富集策略鑒定到72個小蛋白質(zhì)，占酵母已注釋PE1小蛋白質(zhì)的35%，并成功驗證了9個漏檢蛋白。一些難檢測的小蛋白質(zhì)和漏檢蛋白往往具有類似特征，如低分子量、低豐度、強疏水性、膜結(jié)合、弱密碼子使用偏性以及蛋白不穩(wěn)定性等。這些典型的特征暗示我們后續(xù)可在以下幾方面進行優(yōu)化：1) 表達條件的優(yōu)化[20]；2) 蛋白質(zhì)半衰期的延長；3) 基于亞細胞定位的提取策略(如膜蛋白質(zhì))；4) 消化策略的改進(針對疏水蛋白的多酶組合、化學切割[21]、消化條件[22]以及自上而下蛋白質(zhì)組學策略[23])。隨著對小蛋白質(zhì)特性的深入理解、樣品制備技術的改進以及質(zhì)譜技術的發(fā)展，有望實現(xiàn)小蛋白質(zhì)的深度覆蓋，這將為其功能探究奠定技術支撐。

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Identification of missing proteins inbysmall protein-based enrichment

Cuitong He1,2, Yao Zhang2,3,Ying Jiang1,2, and Ping Xu1,2

1 Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui, China 2 Beijing Institute of Radiation Medicine, State Key Laboratory of Proteomics, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Proteome Research Center, Beijing 102206, China 3 School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, Guangdong, China

Small proteins (SPs) are defined as peptides of 100 amino acids or less encoded by short open reading frames (sORFs). SPs participate in a wide range of functions in cells, including gene regulating, cell signaling and metabolism. However, most annotated SPs in all living organisms are currently lacking expression evidence at the protein level and regarded as missing proteins (MPs). High efficient SPs identification is the prerequisite for their functional study and contribution to MPs searching. In this study, we identified 72 SPs and successfully validated 9 MPs frombased on SPs enrichment strategy. In-depth analysis showed that the missing factors of MPs were low molecular weight, low abundant, hydrophobicity, lower codon usage bias and unstable. The small protein-based enrichment can be used as MPs searching strategy, which might provide the foundation for their further function research.

proteomics, small protein, enrichment, missing protein

January 30, 2018;

March 12, 2018

Chinese National Basic Research Programs (No. 2017YFC0906600), National Natural Science Foundation of China (No. 31670834), Beijing Training Project for The Leading Talents in S&T (No. Z161100004916024).

Ping Xu. Tel: +86-10-61777113; Fax: +86-10-61777050; E-mail: xupingghy@gmail.com

Ying Jiang. Tel: +86-10-80705299; Fax: +86-10-80705002; E-mail: jiangying304@hotmail.com

10.13345/j.cjb.180046

國家重大研發(fā)計劃精準醫(yī)學重大專項 (No. 2017YFC0906600)，國家自然科學基金(No. 31670834)，北京市百名領軍人才計劃 (No. Z161100004916024) 資助。

(本文責編 郝麗芳)