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普通小麥-大賴草易位系T6DL·7LrS的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

2018-12-07 01:04:42張雅莉王林生
生物工程學(xué)報(bào) 2018年11期
關(guān)鍵詞:普通小麥原位雜交易位

張雅莉,王林生

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普通小麥-大賴草易位系T6DL·7LrS的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定

張雅莉1,2,王林生1,2

1 河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽 471023 2 洛陽市作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 洛陽 471023

張雅莉, 王林生. 普通小麥-大賴草易位系T6DL·7LrS的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1823–1830.Zhang YL, Wang LS. Molecular and cytogenetic identification of Triticumaestivum-Leymus racemosus translocation lineT6DL·7LrS. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1823–1830.

大賴草高抗小麥赤霉病, 將大賴草抗性基因?qū)肫胀ㄐ←? 對(duì)創(chuàng)新小麥赤霉病抗性種質(zhì)有重要意義。為了獲得普通小麥-大賴草抗赤霉病易位系,采用12 00 R60Co-γ射線處理小麥-大賴草二體附加系 DA7Lr花粉, 授予已去雄的普通小麥中國春,對(duì)其后代(M1) 種子根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體進(jìn)行GISH分析,獲得了1株具有1條普通小麥-大賴草易位染色體的植株,讓其自交,對(duì)自交后代中具有2條易位染色體植株的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)2條易位染色體形成了穩(wěn)定的棒狀二價(jià)體,表明該植株為純合體。利用順序GISH-雙色FISH分析,結(jié)合小麥D組專化探針Oligo-pAs1-2和B組?;结極ligo-pSc119.2-2,進(jìn)一步鑒定出該普通小麥-大賴草易位系為T6DL·7LrS,該易位系的育成也為小麥赤霉病遺傳改良提供了新種質(zhì)。

普通小麥,大賴草,易位系,分子細(xì)胞遺傳學(xué)

大賴草(,2=4x=28,NsNsXmXm) 又稱巨大冰麥草、大穗濱麥草,是禾本科賴草屬草本植物,主要分布于北半球寒溫帶,在我國主要分布于新疆維吾爾自治區(qū)[1]、內(nèi)蒙古自治區(qū)[2]的沙地和沙丘上。大賴草作為小麥的近緣野生物種,具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、抗小麥三銹(稈銹、條銹、葉銹)、赤霉病、黃矮病及根腐病等生物和非生物脅迫[3-5],是一種優(yōu)異的小麥育種基因資源。

Mujeeb-Kazi等[6]成功獲取普通小麥和大賴草的雜交種,并證明其高抗赤霉病。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部作物細(xì)胞遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從1983年開始將大賴草的有益基因?qū)肫胀ㄐ←湹难芯?,獲得了一批異附加系,并從中篩選出了具有較高赤霉病抗性的普通小麥–大賴草異附加系A(chǔ)ddLr.2”、AddLr.7”和AddLr.14”[7]。Qi等[8]證明了Lr.2和Lr.14分別屬于小麥的第7和第5部分同源群。為了減少大賴草整條染色體給普通小麥帶來的冗余基因,遺傳育種工作者采用了電離輻射、殺配子和Ph基因等方法創(chuàng)造易位系,以減少不利基因?qū)ζ胀ㄐ←溵r(nóng)藝性狀造成的不良影響。劉文軒等[9]利用電離輻射大賴草單體異附加系Lr.7而得到了易位系T02和T08。王林生等[10]通過60Co-γ射線處理小麥-大賴草二體附加系DA5Lr雌配子,獲得了普通小麥-大賴草染色體相互易位系T7DS·5LrL/T5LrS·7DL;崔承齊等[11]通過電離輻射得到了T7BS·7Lr#1S和T2AS·2AL-7Lr#1S易位系。

本研究在此基礎(chǔ)上,通過電離輻射異附加系DA7Lr的花粉創(chuàng)造普通小麥-大賴草易位系,利用熒光原位雜交、分子標(biāo)記技術(shù)和赤霉病抗性鑒定等技術(shù),對(duì)輻射后代進(jìn)行鑒定,篩選出抗赤霉病的普通小麥–大賴草易位系,為小麥抗赤霉病育種提供新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用60Co-γ射線(劑量1 200 Rad,劑量率100 Rad/min) 照射普通小麥–大賴草二體異附加系DA7Lr開花期麥穗,輻射花粉與普通小麥中國春雜交,讓其后代種子自交,鑒定出純合易位系。抗赤霉病對(duì)照品種蘇麥3號(hào)和感赤霉病品種中國春由河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種研究室引進(jìn)保存。

熒光原位雜交所用的兩種小麥?;押塑账嶂貜?fù)序列的探針Oligo-pAs1-2 (Tamra-5′-CATTT CATCCACATAGCATGTGCAAGAAATTTGAGAG GGTTACGGCAAAAACTGGAT-3′)和Oligo-pSc119.2-2 (6-FAM-5′-TTCCACGATTGACGATTCCG GGG GTGCGTTTACGTGTCCGTCGTC-3′) 由上海英駿生物科技有限公司合成,熒光素Fluorescein- l2-dUTP和CY3-dUTP也由該公司提供。

1.2 染色體制片

1.2.1 根尖細(xì)胞有絲分裂中期

將小麥種子放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)根(23 ℃),待根長至1.0?2.0 cm時(shí),剪取1?2條種子根在冰水中處理20?24 h。用3份無水乙醇∶1份冰醋酸固定液固定,4 ℃冰箱中保存3 d后于45%醋酸中進(jìn)行根尖壓片,相差顯微鏡下染色體觀察,放入?70 ℃冰箱或液氮中冷凍揭去蓋玻片,脫水備用。

1.2.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ

挑取處于減數(shù)分裂中期Ⅰ的花藥,用3份無水乙醇∶1份冰醋酸固定液固定,按根尖細(xì)胞有絲分裂中期制片方法壓片。

1.3 染色體C-分帶和熒光原位雜交

參照Gill等[12]的方法進(jìn)行染色體C-分帶。熒光原位雜交參照Mukai等[13]的方法稍加修改進(jìn)行。參照Zhang 等[14]的方法順次原位雜交,首先以大賴草基因組DNA為探針進(jìn)行基因組原位雜交,通過SPOT CCD (Charge coupled device) 獲取FISH圖像,然后將信號(hào)洗脫,再以紅色熒光標(biāo)記Oligo-pSc119.2-2和綠色熒光標(biāo)記Oligo-pAs1-2為探針進(jìn)行雙色熒光原位雜交,用DAPI (4?,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 染色,用SPOT CCD (Charge coupled device) 獲取圖像。圖像結(jié)果參照Tang等[15]的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行分析。

1.4 分子標(biāo)記鑒定

植物DNA提取參照Sharp[16]的SDS法。采用10 μL PCR反應(yīng)體系,模板DNA 20 ng、 1.5 mmol/L MgCl2、1× 緩沖液、200 mmol/L dNTPs、終濃度各為0.2 μmol/L的左右引物、0.5 UDNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,50?60 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,硝酸銀染色后照相分析。

1.5 赤霉病抗病性鑒定

抗性鑒定在河南科技大學(xué)開元校區(qū)農(nóng)場進(jìn)行,試驗(yàn)按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。采用王裕中等[17]的單花滴注法接種禾谷鐮刀菌(菌種由河南科技大學(xué)林學(xué)院植物病理系徐建強(qiáng)博士提供),接種后早晚兩次噴霧,保證禾谷鐮刀菌的發(fā)病濕度。2015?2017年連續(xù)3年均使用編號(hào)為LHLY-2高強(qiáng)毒菌株分生孢子懸浮液。每小區(qū)接種10穗,接種21 d后,調(diào)查接種穗的發(fā)病小穗數(shù)和總小穗數(shù),計(jì)算病小穗率。病小穗率(%)=(病小穗數(shù)/總小數(shù))×100。調(diào)查結(jié)果采用Spss軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 易位系T6DL·7LrS的分子細(xì)胞學(xué)鑒定

采用劑量1 200 Rad60Co-γ射線(劑量率 100 Rad/min) 照射普通小麥-大賴草二體異附加系DA7Lr開花期麥穗,將輻射附加系的花粉授予已去雄普通小麥中國春,對(duì)其后代種子進(jìn)行熒光原位雜交(FISH) 分析,發(fā)現(xiàn)一株編號(hào)為NGH-02單株具有1條普通小麥-大賴草易位染色體,從自交后代種子中得到了1株含有2條易位染色體的單株,根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體制片,相差顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù),2=44。

以綠色熒光標(biāo)記大賴草基因組DNA并作為探針,對(duì)NGH-02純合單株根尖染色體制片進(jìn)行基因組原位雜交。結(jié)果顯示,用熒光顯微鏡于450?490 nm激發(fā)光波長下可以觀察到易位染色體的大賴草片段有彌散的綠色熒光雜交信號(hào),且大賴草染色體端部有很強(qiáng)的雜交信號(hào),易位的大賴草染色體片段為7Lr整個(gè)短臂即7LrS,易位的小麥染色體片段為某小麥染色體的一個(gè)臂(圖1A)。因此可以判定該易位染色體是發(fā)生 在大賴草7LrS與普通小麥染色體之間的整臂 易位。

為了進(jìn)一步確定易位染色體中小麥染色體片段的來源,將以大賴草基因組DNA為探針進(jìn)行基因組原位雜交的信號(hào)洗脫干凈,再以紅色熒光標(biāo)記的小麥B組?;结極ligo-pSc119.2-2和綠色熒光標(biāo)記的小麥D組?;结極ligo-pAs1-2進(jìn)行雙色熒光原位雜交。原位雜交結(jié)果顯示,在易位小麥染色體臂上有4個(gè)明顯的綠色Oligo-pAs1-2點(diǎn)狀雜交信號(hào),沒有發(fā)現(xiàn)紅色的Oligo-pSc119.2-2的雜交信號(hào)(圖1B)。因此可以判斷易位的小麥染色體片段應(yīng)為D組染色體。參照Tang[15]的原位雜交圖譜,與這一熒光雜交信號(hào)特征相似的小麥染色體有3D、4D、5D、6D和7D。3D的短臂上有4個(gè)與易位染色體相似的雜交信號(hào),但其短臂頂端同時(shí)具有Oligo-pSc119.2-2的雜交信號(hào),可排除3D染色體;小麥4D和5D染色體長臂在著絲粒處還有明顯的Oligo-pAs1-2 2個(gè)點(diǎn)狀雜交信號(hào),它們的長臂上有6個(gè)點(diǎn)狀雜交信號(hào),故二者也排除。小麥7D染色體長臂上雖然有4個(gè)點(diǎn)狀Oligo-pAs1-2雜交信號(hào),但位于長臂的近端處相距較近。而易位染色體的4點(diǎn)Oligo-pAs1-2雜交信號(hào),其中2點(diǎn)位于長臂近著絲粒處,另兩點(diǎn)位于長臂近端部(圖1B和圖2),因此在小麥D染色體中,只有6D染色體符合此特點(diǎn)。

對(duì)其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體行為進(jìn)行觀察分析,發(fā)現(xiàn)3條易位染色體正常配對(duì),形成了穩(wěn)定的棒狀二價(jià)體(圖3),因此,該易位系命名為T6DL·7LrS。

圖1 易位系T6DL·7LrS熒光原位雜交(2n=44)

圖2 易位染色體T6DL·7LrS熒光原位雜交

圖3 易位系T6DL·7LrS花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的熒光原位雜交

2.2 易位系的分子標(biāo)記鑒定

根據(jù)小麥第7部分同源群不同區(qū)段的EST序列合成了81對(duì)EST-STS引物。經(jīng)多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)有3對(duì)引物在大賴草、DA7Lr和易位系T6DL·7LrS上有特異擴(kuò)增,它們分別是BE591127、BQ168298和BE591737,均定位在第7同源群的7DS、7AS和7BS上,擴(kuò)增出的3條特異條帶,大小約1 000 bp、1 733 bp和398 bp (圖4)。因 此,可以利用這3對(duì)特異引物追蹤大賴草染色 體片段,鑒定含有該大賴草染色體片段的易位染色體。

2.3 易位系T6DL·7LrS的赤霉病抗性鑒定

經(jīng)過連續(xù)3年的赤霉病接種鑒定,結(jié)果表明,易位系T6DL·7LrS的病小穗率顯著低于感病親本中國春和感病對(duì)照綿陽85-45,但稍高于抗病對(duì)照蘇麥3號(hào)(表1和圖5),表現(xiàn)出了較好的赤霉病抗性。

圖4 三對(duì)引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1 T6DL·7LrS的赤霉病病小穗率

** indicate significant difference at<0.01 between the material and Chinese Spring.

圖5 易位系T6DL·7LrS的赤霉病抗性鑒定

3 討論

赤霉病是發(fā)生在溫暖濕潤麥區(qū)的一種災(zāi)難性病害,是一個(gè)世界性難題[18]。近幾年不斷往長江以北蔓延,并有明顯擴(kuò)展和加重趨勢(shì),僅河南省小麥赤霉病發(fā)生面積達(dá)100萬公頃之多。究其原因是缺乏赤霉病抗性親本,種質(zhì)資源狹窄,仍大多局限于蘇麥3號(hào)、Frontana等少數(shù)品種及其衍生系,很難有突破性進(jìn)展。2017年國家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定通過的20個(gè)半冬性小麥品種及河南省審定通過的27個(gè)小麥品種全部高感赤霉病,致使我國小麥主產(chǎn)區(qū)存在巨大的安全隱患。因此,拓寬赤霉病育種遺傳基礎(chǔ)已成為育種工作者的當(dāng)務(wù)之急。

大賴草作為普通小麥的近緣野生植物,高抗小麥赤霉病,早已引起研究者的高度重視。自20世紀(jì)80年代南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部作物細(xì)胞遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育出高抗赤霉病的普通小麥大賴草異附加系以來,遺傳育種工作者采用電離輻射、殺配子染色體等方法創(chuàng)造了一批普通小麥-大賴草易位系。劉文軒和楊寶軍等[19-20]通過輻射Lr.2和Lr.7單體異附加系獲得了易位系NAU618和NAU601。袁建華等[21]采用殺配子染色體誘導(dǎo)方法得到了3個(gè)易位系T1DS.Lr7L、T4AL.4AS-Lr7S和T1BL-Lr2S,這些易位系對(duì)赤霉病均表現(xiàn)較好的抗性,并在育種上進(jìn)行了初步嘗試。我們通過電離輻射小麥–大賴草二體附加系DA7Lr花粉創(chuàng)造出的普通小麥-大賴草易位系T6DL·7LrS,初步鑒定高抗小麥赤霉病,可以作為赤霉病抗性育種的中間材料。

盡管創(chuàng)造易位系的方法有多種,但電離輻射是最常用和最有效的方法之一。從Sears[22]采用電離輻射獲得小麥-小傘山羊草易位系以來,已創(chuàng)造了許多具有外源有益基因的小麥新種質(zhì)[23-28],為小麥育種發(fā)揮了重要作用。但由于電離輻射造成染色體斷裂重接完全是隨機(jī)的,產(chǎn)生的易位染色體補(bǔ)償性往往較差,育種上直接利用還存在一定困難。本研究獲得的易位系T6DL·7LrS,屬于大賴草7Lr短臂與6D長臂的整臂易位,補(bǔ)償性存在一定缺陷,同時(shí)也帶入了大賴草的不利基因,造成結(jié)實(shí)性較差、植株較高、生育期延遲、千粒重較低等不良農(nóng)藝性狀,因此,可以在此易位系的基礎(chǔ)上,創(chuàng)造攜帶大賴草有益基因的小片段 易位,尤其是中間插入易位已成為下一步研究的目標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究采用電離輻射的方法創(chuàng)造普通小麥大賴草易位系,并利用GISH-FISH雙色熒光原位雜交技術(shù),鑒定出了易位系T6DL·7LrS,并篩選出了3個(gè)在易位系T6DL·7LrS上有特異擴(kuò)增的EST-STS多態(tài)性標(biāo)記BE591127、BQ168298和BE591737,可有效追蹤大賴草染色體片段。為赤霉病抗病育種提供了新思路。

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Molecular and cytogenetic identification of-translocation lineT6DL·7LrS

Yali Zhang1,2, and Linsheng Wang1,2

1 College of Agriculture, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023, Henan, China 2 Luoyang Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Germplasm Innovation,Luoyang 471023, Henan, China

had a high resistant capacity to wheat scab (Fusarum head blight). The transfer of scab resistant gene fromtois of great significance for broadening the germplasm of wheat resistance. To obtain-translocation line with scab resistance, we irradiated the pollen ofdisomic addition line DA7Lr by60Co-γ-rays 1 200 R (100 R/min) prior to pollinating to emasculationcv. Chinese Spring. One plant with one translocation chromosome was detected in the M1by GISH. The plant with one translocation chromosome was self-pollinated, and at meiotic metaphase I its progenies with two translocation chromosomes were analyzed for chromosome pairing behavior in their pollen mother cells (PMCs). One rod bivalent was observed at meiotic metaphase I, indicating that the plant with two translocation chromosomes was one translocation homozygote. Sequential GISH-FISH analysis, using Oligo-pAs1-2 and Oligo-pSc119.2-2 as probe, translocation line was confirmed as T6DL·7LrS. The translocation line had higher resistance to wheat scab and feasibility to be used as a new source in wheat breeding resistant to scab disease.

,, translocation line, molecular and cytogenetics

February 21, 2018;

April 23, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31501301), Henan International Cooperation Program (No. 172102410052).

Linsheng Wang. Tel: +86-379-64282340; E-mail: 964965931@qq.com

10.13345/j.cjb.180066

國家自然科學(xué)基金 (No. 31501301),河南省國際合作項(xiàng)目 (No. 172102410052) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)

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