方正武　馬東方

摘要：普通小麥-簇毛麥易位系V8360具有抗逆性強(qiáng)、抗條銹性強(qiáng)和抗白粉性強(qiáng)等許多優(yōu)良的生物學(xué)特性。用9個(gè)中國目前流行的條銹菌生理小種對V8360進(jìn)行了抗條銹性評(píng)價(jià)，表明該易位系具有良好的抗條銹性。以條銹菌小種CYR32對V8360與感病品種銘賢169配置的F1、F2、F3和BC1代進(jìn)行苗期抗條銹性遺傳分析，并對其中一個(gè)F2代群體進(jìn)行了SSR標(biāo)記。結(jié)果表明，V8360對條銹菌CYR32的抗病性由1對顯性核基因控制，暫命名為YrV8360。從329對SSR引物中篩選到位于小麥4AL染色體上的4個(gè)SSR位點(diǎn)Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257與該基因連鎖。

關(guān)鍵詞：普通小麥-簇毛麥易位系； 抗病基因； 遺傳分析； SSR標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S512.103.53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1042-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.005

Abstract： Stripe rust， caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici， is one of the most widespread and destructive wheat diseases worldwide. Triticum aestivum-Haynaldia villosa translocation line V8360 has strong resistance to abiotic stresses， high resistance to stripe rust and powdery mildew， good biological characteristics. To identify the resistance gene（s） against stripe rust， V8360 was crossed with the susceptible genotype Mingxian 169， F1， F2， F3 and BC1 progenies were analyzed with Chinese race CYR32 at stage of seedling. SSR techniques were used to screen markers linked to the gene conferring resistance to CYR32 in V8360. The results showed that the stripe rust resistance of V8360 was controlled by a single dominant gene， which was temporarily named as YrV8360. Four simple sequence repeat （SSR） markers located on chromosome arm 4AL， Xwmc161， Xgwm565， Xgwm494 and Xcfd257 were linked to YrV8360.

Key words： Triticum aestivum-Haynaldia villosa translocation line； resistance gene； genetic analysis； SSR molecular mapping

由條形柄銹菌小麥?；停≒uccinia striiformis f. sp. tritici）引起的小麥條銹病是世界各主要麥區(qū)的重要病害之一[1]。而且小麥條銹病在中國分布范圍較廣，主要集中在西北、西南、黃淮海等冬麥區(qū)以及西北春麥區(qū)。迄今，小麥條銹病發(fā)生的8次大面積的暴發(fā)流行給中國小麥生產(chǎn)帶來巨大損失[2，3]。由于抗條銹品種的單一化種植，加速了條銹菌毒性結(jié)構(gòu)的變異，加速了小麥主栽品種抗條銹性的喪失。雖然農(nóng)藥（粉銹寧等）的大面積及時(shí)使用可以控制該病害，但要投入大量的人力、物力、財(cái)力，而且容易造成污染環(huán)境。大量國內(nèi)外實(shí)踐表明，種植抗病品種是防治小麥條銹病最有效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的措施[4]。因此，引進(jìn)、鑒定、篩選有效的抗條銹種質(zhì)資源，挖掘其中的抗病基因，對實(shí)現(xiàn)小麥抗條銹基因多樣化，培育持久抗條銹病小麥品種十分必要[5]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因分子作圖技術(shù)的日益完善，目前已發(fā)展了多種以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，如SSR、RGAP、SNP、AFLP等。簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、物種進(jìn)化、基因的分子作圖等研究。目前，利用SSR方法已將許多小麥條銹病抗病性基因定位，大部分已正式命名的小麥抗條銹病基因均已獲得與其緊密連鎖的SSR標(biāo)記[6]。

因?qū)π←湕l銹病、白粉病、全蝕病等病害具有良好抗性，同時(shí)分蘗能力強(qiáng)、耐干旱、耐鹽堿等優(yōu)良性狀，簇毛麥（Haynaldia villosa，2n=14）近年來已引起眾多育種工作者的關(guān)注[7，8]。傅杰等[9]通過普通小麥與簇毛麥雜交選育出一系列易位系、代換系和附加系，為利用這一種質(zhì)資源提供了試驗(yàn)材料。井金學(xué)等[10]研究發(fā)現(xiàn)，簇毛麥的抗銹基因具有較強(qiáng)的傳遞性，可轉(zhuǎn)移至普通小麥中。本研究旨在對普通小麥-簇毛麥易位系V8360進(jìn)行抗條銹性鑒定，明確V8360的抗條銹病遺傳規(guī)律，挖掘其抗病基因，加快對這一種質(zhì)資源的利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥材料為普通小麥-簇毛麥易位系V8360、感病對照為銘賢169、簇毛麥、白粒高38、普通小麥“7182”、V8360與銘賢169雜交后代F1、F2、F3、BC1群體，其中V8360是由簇毛麥與白粒高38、普通小麥“7182”雜交選育而成。小麥條銹菌生理小種（致病類型）為CYR27、CYR28、CYR29、CYR30、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-7、Su11-11。

1.2 苗期抗條銹病遺傳分析

將親本、F1、F2、BC1F1以及F3家系種植于直徑為20 cm的花盆中，置于溫室按常規(guī)方法培養(yǎng)。在供試小麥幼苗生長至二葉期時(shí)，用涂抹法接種小麥條銹菌。接種完成后，將小麥幼苗置于黑暗的保濕箱中24 h。之后轉(zhuǎn)入溫室內(nèi)潛育發(fā)病，溫度為15～17 ℃（晝）/10～12 ℃（夜），光照周期16 h（晝）/8 h（夜）。反應(yīng)型調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)分為11級(jí)，即0、0；、0；+、1、1+、2、2+、3-、3、3+、4。0～2+為抗病，3-～4為感病[11]。統(tǒng)計(jì)雙親、雜交后代各株系的抗感分離比例，用卡方檢驗(yàn)法對期望比例進(jìn)行檢測。

1.3 基因組DNA的提取和抗、感池的構(gòu)建

基因組DNA提取用CTAB法[12]稍作改進(jìn)。參考Michelmore等[13]提出的抗病池、感病池建立方法，挑選F2代的10株高抗單株DNA、10株高感單株DNA分別等量混合構(gòu)成抗病池（BR）和感病池（BS）。構(gòu)建抗感池的單株均經(jīng)過F3家系驗(yàn)證其對應(yīng)F2代單株的純合性。

1.4 SSR標(biāo)記篩選和遺傳作圖

根據(jù)R？觟der等[14]和http：//wheat.pw.usda.gov公布的小麥染色體上SSR引物序列信息，由上海Invitrogen生命技術(shù)公司合成PCR引物。以V8360、銘賢169、抗病基因池、感病基因池和F2代群體的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯影。篩選與抗病親本相關(guān)的SSR標(biāo)記，進(jìn)而用Map Marker 3.0b軟件計(jì)算各標(biāo)記位點(diǎn)與目的基因的遺傳距離，最后用Map Draw V2.0軟件繪制連鎖圖[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期抗條銹性鑒定結(jié)果

V8360和簇毛麥對CYR27、CYR28、CYR29、CYR30、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-7、Su11-11等9個(gè)條銹菌生理小種表現(xiàn)良好的抗銹性。感病對照品種銘賢169、白粒高38、“7182”對9個(gè)條銹菌均表現(xiàn)高度感病反應(yīng)（表1）。說明V8360是一個(gè)優(yōu)良的抗條銹病種質(zhì)資源。

2.2 抗條銹性遺傳分析

接種CYR32時(shí)，V8360與銘賢169雜交的F1代與抗病親本一樣呈抗病反應(yīng)，BC1代抗病與感病株數(shù)比為10∶9，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合1∶1的分離比；反交組合F2-1中，抗病植株182株，感病植株56株，符合3∶1的分離比例。238株F2單株共收獲232個(gè)F2∶3家系。對應(yīng)的F2∶3家系中，純抗家系63個(gè)，抗感分離家系114個(gè)，純感家系55個(gè)，分離比例符合1∶2∶1；正交組合F1-2中，抗病植株150株，感病植株48株，符合3∶1的分離比例（表2）。上述結(jié)果表明V8360對CYR32的抗病性由1對顯性細(xì)胞核基因控制，暫命名為YrV8360。以F2-1群體的238個(gè)單株構(gòu)建作圖群體，對抗條銹病基因進(jìn)行SSR標(biāo)記。

2.3 YrV8360的SSR標(biāo)記定位

選擇分布于小麥21條染色體上的329對SSR引物對抗病材料V8360、感病材料銘賢169、抗病池及感病池進(jìn)行多態(tài)性篩選。結(jié)果4AL上的引物Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257在V8360、銘賢169及抗感池間同時(shí)擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性片段。對F2代群體進(jìn)行單株擴(kuò)增，結(jié)果大部分抗病單株擴(kuò)增出與抗病親本V8360相同的帶型（A）或雙親的組合帶型（H），而大部分感病單株則擴(kuò)增出與銘賢169一致的帶型（B），由此推測這4個(gè)位點(diǎn)與YrV8360連鎖。

2.4 連鎖遺傳分析

根據(jù)F2分離群體及F2∶3家系反應(yīng)型，確定F2單株的抗感基因型。由F2所有單株的PCR擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以得出，Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257的擴(kuò)增位點(diǎn)與YrV8360有明顯的連鎖關(guān)系 （表3）。用Map Maker 3.0b軟件進(jìn)行連鎖分析，LOD值設(shè)置為3.0，結(jié)果顯示Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257與抗條銹基因的遺傳距離分別為8.6、3.4、4.3和7.5 cM。參照已報(bào)道的小麥遺傳圖譜[16]，根據(jù)抗條銹病基因與所獲得標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系可知，YrV8360位于小麥染色體4AL上，且位于Xgwm565和Xgwmb494之間。據(jù)此繪制了YrV8360遺傳連鎖圖（圖1）。

3 討論

發(fā)掘和鑒定抗條銹病基因是小麥抗病育種的重要工作。開展小麥抗條銹病基因的分子標(biāo)記研究，一方面通過尋找與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，在基因型水平上對作物種質(zhì)資源進(jìn)行深入評(píng)價(jià)和鑒定。另一方面為通過分子標(biāo)記輔助選擇實(shí)現(xiàn)多種基因的累加，培育出多抗或廣譜的種質(zhì)或品種奠定基礎(chǔ)。

普通小麥-簇毛麥易位系V8360具有抗條銹病、白粉病等較強(qiáng)抗性以及多種優(yōu)良農(nóng)藝性狀。本研究發(fā)現(xiàn)普通小麥-簇毛麥易位系V8360對中國優(yōu)勢條銹菌小種CYR32具有良好的抗病性，且抗性由1對顯性核基因YrV8360控制，被定位在4AL上。

目前，正式命名的62個(gè)抗條銹病基因只有Yr51定位在4AL上[17，18]。從染色體位置上分析，Yr51位于染色體長臂末端，而YrV8360位于染色體長臂中間部位，Yr51與YrV8360的距離大約為32.3 cM。從系譜上分析，Yr51的載體品種AUS27858是澳大利亞的農(nóng)家品種，而YrV8360由中國育種工作者自主選育而成，V8360與AUS27858的系譜并無交集。周新力等[19]研究發(fā)現(xiàn)，普通小麥-簇毛麥易位系V9128-1對CYR30的抗條銹病基因YrV1位于小麥染色體3BS上；侯璐等[20]報(bào)道，易位系V9128-3對Su11-4的抗條銹病基因YrHV位于染色體2AL；王睿等[21]把易位系V9125-2對CYR29的抗條銹病基因YrWV定位于染色體7DSS上。因此可以初步斷定，YrV83660不同于普通小麥-簇毛麥易位系V9128-1、V9128-3和V9125-2中的抗銹基因。綜合上述分析，初步判斷YrV8360很可能是一個(gè)不同于已知抗條銹病基因的新基因。

在目前大量抗源和主栽品種對中國目前流行條銹病生理小種CY32喪失抗病性的形勢下，本研究發(fā)現(xiàn)的抗病基因YrV8360對抗病育種顯得尤為寶貴。V8360綜合農(nóng)藝性狀較好，對小麥條銹病又具有良好的抗性，稍加改良就可以用于生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LINE R F. Stripe rust of wheat and barley in North America： A retrospective historical review[J]. Annu Rev Phytopathol， 2002， 40：75-118.

[2] WAN A， ZHAO Z， CHEN X， et al. Wheat stripe rust epidemic and virulence of Puccinia striiformis f. sp. tritici in China in 2002[J]. Plant Disease， 2004， 88（8）：896-904.

[3] WELLINGS C R. Global status of stripe rust： A review of historical and current threats[J]. Euphytica， 2011，179（1）：129-141.

[4] 李振岐，曾士邁.中國小麥銹病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[5] 吳立人，牛永春.我國小麥條銹病持續(xù)控制的策略[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（5）：46-54.

[6] 馬東方，王海鴿，唐明雙，等.小麥品種中梁21抗條銹病基因遺傳分析與SSR標(biāo)記定位[J].作物學(xué)報(bào)，2011，37（12）：1-7.

[7] 劉 萍，楊寶軍，陳佩度.普通小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系抗病性在不同小麥遺傳背景中的傳遞[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004，27（2）：1-5.

[8] 李洪杰，朱至清.簇毛麥的利用價(jià)值和染色體操作[J].植物學(xué)通報(bào)，1999，16（5）：504-510.

[9] 傅 杰，周榮華，陳漱陽，等.小簇麥新種質(zhì)的品質(zhì)、抗病性及分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，29（6）：1-8.

[10] 井金學(xué)，傅 杰，商鴻生，等.三個(gè)小麥野生近緣種屬抗條銹傳遞的初步研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，1999，26（2）：139-143.

[11] 劉孝坤.小麥抗源對條銹病的抗性遺傳研究初報(bào)[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1988，15（1）：33-39.

[12] ROGERS S O， BENDICH A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh， herbarium and mummified plant tissues[J]. Plant Molecular Biology， 1985， 5： 69-76.

[13] MICHELMORE R W， PARAN I， KESSELI R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis： A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating segregating populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1991， 88： 9828-9832.

[14] R？魻DER M S，KORZUN V，WENDEHAKE K，et al. A microeatellite map of wheat[J]. Genetics， 1998， 149： 2007-2023.

[15] 劉仁虎，孟金陵.MapDraw在Excel中繪制遺傳連鎖圖的宏[J]. 遺傳，2003，25（3）：317-321.

[16] SOMERS D J， ISAAC P， EDWARDS K. A high-density microsatellite consensus map for bread wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，109： 1105-1114.

[17] LU Y， WANG M N， CHEN X M， et al. Mapping of Yr62 and a smal-effect QTL for high-temperature adult-plant resistance to stripe rust in spring wheat PI 192252 [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2014， 127： 1449-1459.

[18] RANDHAWA M， BANSAL U， VAL？魣RIK M， et al. Molecular mapping of stripe rust resistance gene Yr51 in chromosome 4AL of wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2014， 127： 317-324.

[19] 周新力，吳會(huì)杰，張如佳，等.來自簇毛麥抗條銹病新基因的SSR標(biāo)記[J].植物病理學(xué)報(bào)，2008，38（1）：69-74.

[20] 侯 璐，宋曉賀，路亞明，等.小簇麥易位系V9128-3抗條銹病基因的遺傳分析和SSR分子標(biāo)記[J].植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（1）：67-75.

[21] 王 睿，張書英，徐中青，等.簇毛麥易位系V9125-2抗條銹基因YrWV的遺傳分析和SSR分子標(biāo)記[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011， 44（1）：9-19.