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蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中MtSERK1的組蛋白修飾狀態(tài)分析

2018-12-07 01:04:44董蔚鄔培祥劉錫江高天雪楊寧宋玉光
生物工程學(xué)報(bào) 2018年11期
關(guān)鍵詞:胚性蒺藜染色質(zhì)

董蔚,鄔培祥,劉錫江,高天雪,楊寧,宋玉光

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蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中的組蛋白修飾狀態(tài)分析

董蔚,鄔培祥,劉錫江,高天雪,楊寧,宋玉光

曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 曲阜 273165

董蔚, 鄔培祥, 劉錫江, 等. 蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中MtSERK1的組蛋白修飾狀態(tài)分析.生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1831–1839.Dong W, Wu PX, Liu XJ, et al. Analysis of histone modification of MtSERK1 during in vitro regeneration in Medicago truncatula. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1831–1839.

表觀遺傳修飾尤其是組蛋白修飾在維持植物基因組穩(wěn)定、調(diào)控基因表達(dá)、促進(jìn)離體再生等方面發(fā)揮了重要作用?;蚴禽疝架俎kx體再生過(guò)程中胚性愈傷組織建立的重要標(biāo)記基因。為了解該過(guò)程中組蛋白修飾與表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控關(guān)系,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法分析了的表達(dá)變化并利用染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 技術(shù)分析了其啟動(dòng)子區(qū)和不同基因結(jié)構(gòu)區(qū)H3K9me2、H3K4me3和H3K9ac修飾狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)在蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中的表達(dá)激活與其5′末端和3′末端區(qū)的組蛋白H3K4me3和H3K9ac修飾的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)。該研究將為深入了解參與蒺藜苜蓿離體再生的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供重要的理論指導(dǎo)。

蒺藜苜蓿,組蛋白修飾,,愈傷組織,離體器官再生

生物工程是以生物學(xué)(特別是其中的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)) 的理論和技術(shù),定向地改造生物或其功能,創(chuàng)造出新物種的一門技術(shù)。在諸多生物工程技術(shù)中,利用基因工程的方式對(duì)植物進(jìn)行遺傳改造是獲得優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)基因植物的一條重要途徑。目前諸如煙草、番茄、小麥、棉花等植物的基因工程改造均是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植株再生 (器官發(fā)生、體細(xì)胞胚發(fā)生) 方式。植物離體再生是指植物外植體 (包括根、下胚軸、子葉及種子等) 在適宜的離體培養(yǎng)環(huán)境中經(jīng)脫分化、再分化等過(guò)程重新誘導(dǎo)出離體苗的生物學(xué)過(guò)程。通常該過(guò)程包括愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎的建立以及離體器官的分化等途徑[1]。植物離體再生效率是植物基因工程改造的重要限制因素。對(duì)于多數(shù)植物來(lái)說(shuō),其離體再生過(guò)程均具有周期長(zhǎng)、效率低等特點(diǎn)。因此,探究植物離體再生的調(diào)控因素及機(jī)制對(duì)于提高轉(zhuǎn)基因效率等方面具有重要的意義。近年來(lái),隨著研究的不斷深入,多個(gè)植物離體再生關(guān)鍵基因逐步被發(fā)掘,如:()、()、()、()、()等,它們的功能缺失或異常表達(dá)均會(huì)引起植物離體再生能力的改變[2-5]?;蚴且粋€(gè)富含亮氨酸的受體樣蛋白激酶 (LRR-RLK)。從1997年在胡蘿卜中首次發(fā)現(xiàn)基因至今,該基因在諸如擬南芥、玉米及水稻等多個(gè)物種逐步被發(fā)現(xiàn)且其功能亦得到證實(shí)[6]。研究表明,無(wú)論在合子胚發(fā)育不同時(shí)期還是在離體胚胎再生過(guò)程中均特異性地在胚性細(xì)胞中表達(dá),已成為確定胚性細(xì)胞的重要標(biāo)記基因[6-9]。

在真核生物基因組中,147 bp 大小的核DNA與組蛋白 (H1、H2A、H2B、H3和H4) 相互纏繞而形成核小體。多個(gè)核小體相互串聯(lián)形成蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),最后經(jīng)過(guò)不斷地折疊包裝形成染色質(zhì)。伸向核小體外側(cè)的不同組蛋白亞單位的N 端尾部,經(jīng)過(guò)甲基化、乙?;⒘姿峄头核鼗刃揎椇?,決定了常染色質(zhì)或異染色質(zhì)的形態(tài),影響著轉(zhuǎn)錄調(diào)控,因此稱它們?yōu)椤敖M蛋白密碼”[10]。在植物中主要存在3種類型的組蛋白甲基化修飾(me1、me2、me3),通常都是發(fā)生在組蛋白H3或H4的賴氨酸 (Lys,K) 和精氨酸 (Arg,R) 殘基上,主要包括H3K4、K9、K27、K36、K79、R2、R17、R26以及H4K20、R3等位點(diǎn)。通常情況下,H3K9、H3K27、H4K20的甲基化多分布于異染色質(zhì)區(qū)域,與基因的轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)[10],例如在小鼠中H3K9me3、H3K27me1和H4K20me3是組成型異染色質(zhì)的標(biāo)志[11]。組蛋白乙?;浅谆揎椧酝獾牧硪环N重要的表觀遺傳修飾,其在穩(wěn)定染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、募集轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。與組蛋白甲基化修飾相比,乙酰化修飾位點(diǎn)更為廣泛,通常發(fā)生在組蛋白H3第9、14、18、23位和H4第5、8、12、16、20位的Lys殘基上,甚至偶爾發(fā)生在H2A和H2B上[11]。在轉(zhuǎn)錄比較活躍的常染色質(zhì)區(qū)域,通常會(huì)伴隨著高水平的組蛋白乙?;揎椀陌l(fā)生,而異染色質(zhì)區(qū)域則經(jīng)常發(fā)生去乙?;揎梉12-13]。

研究發(fā)現(xiàn),植物細(xì)胞在離體再生過(guò)程中均會(huì)發(fā)生大規(guī)模的染色質(zhì)重編程過(guò)程,通過(guò)開啟或關(guān)閉一些基因的表達(dá)來(lái)保持其不同的分化潛能。近期研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥離體再生過(guò)程中,多個(gè)干細(xì)胞維持和分化關(guān)鍵基因的表達(dá)受到了組蛋白修飾的調(diào)控,例如:的表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)及3′末端的DNA甲基化和組蛋白修飾相關(guān)[14];() 的正常表達(dá)與其組蛋白乙酰化修飾相關(guān)[15];、BP/KNAT1和KNAT2的表達(dá)均受到了H3K27甲基化的影響[16];在離體器官發(fā)生過(guò)程中() 和的表達(dá)受到了H3K4乙?;降恼{(diào)控[17-18]。這些結(jié)果說(shuō)明,在植物離體再生過(guò)程中,染色質(zhì)或部分關(guān)鍵基因組蛋白修飾的改變是細(xì)胞重獲全能性并向不同方向分化的一條重要途徑。

蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬一年生或多年生草本植物,由于其倍性小 (2=16)、基因組小(454–526 Mb)、自花受粉、有大量突變體和多種生態(tài)型、具有較高的生物多樣性以及可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化等特點(diǎn),成為豆科分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的模式植物[19]。和其他作物相似,在對(duì)其基因工程改造過(guò)程中,同樣也存在離體再生效率較低、受生態(tài)型制約等缺點(diǎn),因此,了解其離體再生過(guò)程的調(diào)控機(jī)制亦是亟待解決的問(wèn)題。前期研究發(fā)現(xiàn),在蒺藜苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中,與擬南芥高度同源的基因的表達(dá)明顯受到誘導(dǎo),推測(cè)其參與了蒺藜苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程并扮演重要角色[9]。在蒺藜苜蓿的離體再生過(guò)程中,該基因表達(dá)激活是否和擬南芥中一些離體再生關(guān)鍵基因一樣也受到了組蛋白修飾的調(diào)控?其存在哪種類型的組蛋白修飾?這些修飾與其表達(dá)的相互作用關(guān)系是什么?為解決這些問(wèn)題,本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR分析了在離體再生過(guò)程中的表達(dá)變化并利用染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 技術(shù)分析了其啟動(dòng)子區(qū)和基因結(jié)構(gòu)區(qū)不同區(qū)域、不同類型的組蛋白修飾狀態(tài)。在離體再生過(guò)程中的表達(dá)與其基因5′端及3′末端的組蛋白H3K9ac、H3K4me3修飾的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)。本研究為深入了解參與蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及為其高效基因工程遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立等方面提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

選取飽滿均一的蒺藜苜蓿 (生態(tài)型為R108) 種子,進(jìn)行一側(cè)種皮打磨處理,散鋪于兩層濾紙培養(yǎng)皿中,用蒸餾水浸潤(rùn),置于4 ℃冰箱中催芽,待胚根長(zhǎng)至1 cm左右時(shí),將其轉(zhuǎn)移至10 cm×10 cm的培養(yǎng)缽中 (培養(yǎng)基質(zhì)與蛭石比例為3∶1)。期間用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌,培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)16 h,暗培養(yǎng)8 h,光強(qiáng)為300 μmol/(m2·s)飽和光,晝夜溫度為25 ℃/20 ℃,相對(duì)濕度為55%。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)及離體器官再生

愈傷組織的誘導(dǎo)及離體器官的再生主要參考Cosson等的方法和步驟[20]。簡(jiǎn)要描述為:剪取剛要開花的上述植物葉片 (選取舒展、厚實(shí)、色澤鮮綠、健壯的葉片),用新配置的滅菌混合液(在無(wú)菌去離子水中加入0.1%的TW-20和10%的NaClO溶液) 和葉片一起置于大離心管中,輕輕搖晃試管并上下翻轉(zhuǎn),時(shí)間約5–6 min,為保證滅菌效果,清洗葉片2次。然后用無(wú)菌去離子水清除葉片表面殘留的滅菌混合液。用刀片將葉子切成正方形,使其四周均有傷口,將切為正方形的葉片轉(zhuǎn)到含有4 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BAP的SH3a培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)[20],期間每2周更換一次培養(yǎng)基,5–6周便會(huì)形成大量愈傷組織。選取胚性好的材料轉(zhuǎn)移到不含任何激素的SH9a培養(yǎng)基上[20],在光下進(jìn)行離體器官的誘導(dǎo),4–6周后便產(chǎn)生大量的離體苗。

1.3 qRT-PCR分析

選取上述 (1∶2) 中誘導(dǎo)不同時(shí)間的培養(yǎng)物,未經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的葉外植體命名為Mock;SH3a誘導(dǎo)1、3、6周的培養(yǎng)物分別命名為SH3-W1、SH3-W3、SH3-W6;SH9a分化誘導(dǎo)1、3、6周的培養(yǎng)物分別命名為SH9-W1、SH9-W3、SH9-W6。將這些材料平均分成2份,一份用于RNA的提取,另一份用于后續(xù)的染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 分析。用于RNA提取的材料經(jīng)液氮冷凍后,利用植物組織RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Invitrogen) 提取RNA并進(jìn)行cDNA的合成,以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,蒺藜苜?;蜃鲀?nèi)參,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)在愈傷組織誘導(dǎo)及離體器官再生過(guò)程中的表達(dá)情況 (引物序列見表1)。qPCR反應(yīng)體系 (10 μL):ddH2O 3 μL,正向引物 (10 μmol/L) 0.5 μL,反向引物 (10 μmol/L) 0.5 μL,模板cDNA 1.0 μL,ChamQ SYBR Color QPCR Msater Mix (2×) 5 μL (Vazyme,Code:Q411-00)。反應(yīng)條件為兩步法PCR,95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性10 s;60 ℃退火加延伸30 s,延伸完成后收集熒光信號(hào);2–3步循環(huán)40次;60–95 ℃,每隔0.5 ℃作溶解曲線。利用比較t方法 (2–ΔΔCt方法) 分析表達(dá)量[21]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),采用SPSS單因子方差分析程序分析實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果。

1.4 染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 分析

用于檢測(cè)組蛋白修飾狀態(tài)的ChIP方法主要參考文獻(xiàn)[22]。簡(jiǎn)要步驟為:取上述 (1.3)中與RNA提取同一批的培養(yǎng)物1 g,用含有1%甲醛的1×PBS緩沖液真空固定,加入甘氨酸溶液,真空滲透處理,終止交聯(lián),PBS清洗后,液氮速凍后于?80 ℃保存。液氮研磨樣品后分離染色質(zhì)并進(jìn)行超聲破碎使打斷的染色質(zhì)片段長(zhǎng)度為200–1 000 bp。分別利用H3K9ac、H3K9me2和H3K4me3抗體 (Millipore cat. 07-392、05-768R和07-473) 過(guò)夜進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng),然后加入Protein G玻璃珠,4 ℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育4 h。加入洗脫液,65 ℃烘箱中孵育30 min,將蛋白/DNA復(fù)合物從玻璃珠中分離;加5 mol/L NaCl至Input和ChIP樣品中,65 ℃烘箱過(guò)夜解交聯(lián)后加入RNase A,37 ℃孵育1 h,利用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒 (Qiagen,cat. 28104) 對(duì)沉淀下的DNA進(jìn)行回收,用于后續(xù)的qPCR檢測(cè)。每個(gè)樣品分別取1 μL免疫沉淀純化DNA產(chǎn)物 (ChIP-DNA),稀釋10 000倍的基因組DNA (Input) 及與免疫沉淀反應(yīng)同步進(jìn)行未加抗體的純化產(chǎn)物 (No-Ab) 進(jìn)行qPCR檢測(cè),針對(duì)每一個(gè)樣品同時(shí)用組蛋白H3抗體進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),以對(duì)不同樣品的免疫沉淀產(chǎn)物進(jìn)行均一化處理,以作為內(nèi)參。用于檢測(cè)不同區(qū)域的qPCR引物見表1,qRT-PCR程序同上。每個(gè)樣品組蛋白修飾水平均以免疫沉淀后該樣品DNA豐度占Input的百分比來(lái)表示[23],實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR及ChIP-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及離體器官再生

將滅菌后的葉片外植體置于含有4 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BAP的SH3a培養(yǎng)基上(圖1A),暗培養(yǎng)誘導(dǎo)1周后,葉片逐漸膨脹且玻璃化(圖1B),培養(yǎng)3周后逐漸誘導(dǎo)出肉質(zhì)薄壁、微微呈淺綠的愈傷組織(圖1C),期間將外植體轉(zhuǎn)移到新的SH3a培養(yǎng)基中,繼續(xù)誘導(dǎo)至6周,愈傷組織顏色發(fā)生變化,綠色漸漸消失,變?yōu)闇\白色,有大量的顆粒狀的胚狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生(圖1D)。挑選胚性較好愈傷組織,將其轉(zhuǎn)移到SH9a分化培養(yǎng)基上,光下培養(yǎng)進(jìn)一步誘導(dǎo)離體器官的再生。在SH9a培養(yǎng)基上1周后,愈傷組織又逐漸變成淺綠色(圖1E),繼續(xù)培養(yǎng)3周后,在愈傷組織不同部位出現(xiàn)了大量的綠點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)(圖1F,箭頭所示),這些綠點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)即為新建立的干細(xì)胞組織中心,將來(lái)分化出不同的器官,6周后愈傷組織上出現(xiàn)大量的叢生芽(圖1G)。

2.2 蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中MtSERK1的表達(dá)分析

為了解在蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中的表達(dá)情況,利用qRT-PCR的方法分析了在上述不同誘導(dǎo)條件和時(shí)間培養(yǎng)物中的表達(dá),結(jié)果表明:在對(duì)照 (Mock) 中的表達(dá)水平很低 (圖2),當(dāng)SH3a誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后,的表達(dá)明顯受到誘導(dǎo) (圖2),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),在SH3a誘導(dǎo)培養(yǎng)3周到6周后,該基因的表達(dá)水平亦逐步升高,分別上調(diào)3.4和5.3倍 (圖2)。繼續(xù)在SH9a分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后,該基因的表達(dá)水平與SH3a誘導(dǎo)培養(yǎng)6周的培養(yǎng)物相比并沒(méi)有顯著變化,且這種表達(dá)水平一直維持到SH9a分化培養(yǎng)3周以后,然而當(dāng)在SH9a培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)6周后,的表達(dá)顯著下降 (圖2)。上述結(jié)果表明,可能主要參與了蒺藜苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的體細(xì)胞胚胎的發(fā)生或胚性細(xì)胞的建立,而在離體器官再生作用中并不顯著。

圖1 蒺藜苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及離體器官再生過(guò)程

圖2 蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中MtSERK1的表達(dá)分析

2.3 蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中MtSERK1的組蛋白修飾狀態(tài)分析

組蛋白修飾類型非常豐富,當(dāng)然不同類型的修飾對(duì)染色體結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)的影響也不盡相同。通常情況下H3K9me2甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān),相反H3K4me3及H3K9ac修飾則調(diào)控了基因的轉(zhuǎn)錄激活[24]。通過(guò)對(duì)的基因序列分析發(fā)現(xiàn),該基因存在11個(gè)外顯子、10個(gè)內(nèi)含子 (圖3A)。因此,我們利用ChIP-qPCR方法對(duì)在蒺藜苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生以及離體器官再生過(guò)程中其啟動(dòng)子區(qū) (檢測(cè)區(qū)Ⅰ:ATG上游?713 bp–?607 bp);基因5′端 (檢測(cè)區(qū)Ⅱ:ATG上游?8 bp–ATG下游184 bp,檢測(cè)區(qū)Ⅲ:ATG下游445 bp–664 bp);基因中部區(qū)域 (檢測(cè)區(qū)Ⅳ:ATG下游1 643 bp–1 933 bp,檢測(cè)區(qū)Ⅴ:ATG下游2 377 bp–2 571 bp);基因的3′末端區(qū)域 (檢測(cè)區(qū)Ⅵ:ATG下游3 753 bp–3 880 bp) 這6個(gè)區(qū)域的組蛋白H3K9me2、H3K4me3和H3K9ac修飾水平進(jìn)行了檢測(cè)。從組蛋白修飾類型分析:在所有的6個(gè)檢測(cè)區(qū)中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)H3K9me2修飾的明顯變化。在含有4 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BAP的SH3a培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)1周的培養(yǎng)物SH3-W1中,位于該基因5′端的檢測(cè)區(qū)Ⅱ中H3K4me3修飾水平明顯升高 (與對(duì)照相比升高2.4倍) (圖3C),繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)至3周后,在SH3-W3中檢測(cè)區(qū)Ⅲ和檢測(cè)區(qū)Ⅲ中的H3K4me3修飾水平相比對(duì)照分別升高2.8和3.1倍 (圖3C,D),并且隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)以及培養(yǎng)條件的改變,這兩個(gè)區(qū)域的H3K4me3修飾水平并沒(méi)有顯著變化 (圖3C,D)。另外在該基因的3′末端區(qū)域,在SH3a誘導(dǎo)培養(yǎng)3周的培養(yǎng)物SH3-W3中,均檢測(cè)到H3K4me3和H3K9ac修飾水平的明顯升高,在SH3a誘導(dǎo)培養(yǎng)6周的培養(yǎng)物SH3-W6中達(dá)到最高,繼而在SH9a分化培養(yǎng)條件下修飾水平逐漸降低 (圖3G)。從組蛋白修飾區(qū)域分析,位于啟動(dòng)子區(qū)的檢測(cè)區(qū)Ⅰ以及位于基因中部的檢測(cè)區(qū)Ⅳ和Ⅴ中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何上述3種組蛋白修飾的改變 (圖3B、E、F);位于基因5′端的檢測(cè)區(qū)Ⅱ和Ⅲ,無(wú)論在愈傷組織誘導(dǎo)階段還是在離體器官再生階段均發(fā)生了高水平的H3K4me3修飾 (圖3C,D);位于基因3′端的檢測(cè)區(qū)Ⅵ在SH3a誘導(dǎo)培養(yǎng)3周以后均發(fā)生了高水平的H3K4me3和H3K9ac修飾,且誘導(dǎo)培養(yǎng)6周后修飾水平達(dá)到最高,繼續(xù)在SH9a培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)后其H3K4me3和H3K9ac修飾水平則均逐漸降低 (圖3G)。

3 討論

植物的離體再生是指離體的組織或細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下重新形成新器官或個(gè)體的過(guò)程,是對(duì)植物進(jìn)行生物工程改造的重要途徑[25]。一般認(rèn)為植物離體再生存在直接和間接兩種途徑,前者不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段,而后者需要先脫分化形成愈傷組織,然后經(jīng)過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生,最后產(chǎn)生離體器官或個(gè)體。通常情況下,植物離體再生過(guò)程主要經(jīng)歷以下3個(gè)階段:1) 細(xì)胞對(duì)外源激素作出識(shí)別、經(jīng)脫分化逐漸形成胚性愈傷組織;2) 胚性愈傷組織在激素的作用下形成體細(xì)胞胚;3) 體細(xì)胞胚進(jìn)行再分化形成不同的器官[1]。本研究中,蒺藜苜蓿葉外植體經(jīng)含有4 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BAP的SH3a誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后葉片明顯膨脹且玻璃化 (圖1B),隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至3到6周后,產(chǎn)生大量胚性細(xì)胞團(tuán) (圖1C,D),在此過(guò)程中的表達(dá)明顯上調(diào),且在SH9a誘導(dǎo)1周的培養(yǎng)物中表達(dá)水平達(dá)到最高 (圖2)。當(dāng)SH3a誘導(dǎo)6周的愈傷組織轉(zhuǎn)移到不含激素的分化培養(yǎng)基SH9a上3周后,愈傷組織逐漸形成大量新的干細(xì)胞組織中心 (圖1F),繼續(xù)分化培養(yǎng)6周后出現(xiàn)大量的叢生芽 (圖1G),而在此過(guò)程的表達(dá)則逐漸下降 (圖2)。上述結(jié)果表明的確與離體條件下胚性愈傷組織的建立有關(guān),這與前期的研究結(jié)論是一致的[9]。Nolan等研究表明,的表達(dá)受生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)[9]。文中在含有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的SH3a培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段,表達(dá)明顯受到誘導(dǎo);在不含激素的SH9a培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)時(shí)表達(dá)水平則逐漸下降。因此我們推測(cè)參與離體胚性愈傷組織的建立可能與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的響應(yīng)有關(guān),但這需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖3 蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中MtSERK1的組蛋白修飾狀態(tài)分析

多項(xiàng)研究證實(shí)組蛋白修飾參與了植物離體組織或器官的再生過(guò)程[14-18]。本研究對(duì)蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程中啟動(dòng)子區(qū)及基因的5′端和3′端等不同區(qū)域的組蛋白H3K9me2、H3K4me3和H3K9ac修飾水平進(jìn)行了分析。離體再生過(guò)程中,在SH3a誘導(dǎo)1周的培養(yǎng)物中表達(dá)開始上調(diào),隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至6周,表達(dá)水平繼續(xù)升高,在SH9a分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后表達(dá)水平達(dá)到最高 (圖2)。在此過(guò)程中,伴隨著的誘導(dǎo)表達(dá),其5′端的兩個(gè)檢測(cè)區(qū)域 (Ⅱ和Ⅲ) H3K4me3以及3′端H3K4me3和H3K9ac修飾水平均有不同程度升高(圖3),因此推測(cè)的5′端及3′端組蛋白H3K4me3和H3K9ac修飾水平的變化可能與該基因的轉(zhuǎn)錄激活存在相關(guān)性。隨著在分化培養(yǎng)基SH9a上培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(3–6周),胚性愈傷組織逐漸減少,離體再生器官逐漸出現(xiàn),的表達(dá)逐漸下調(diào),在該過(guò)程中的5′端兩個(gè)檢測(cè)區(qū)域H3K4me3的修飾水平并沒(méi)有顯著降低,而3′端組蛋白H3K4me3和H3K9ac修飾水平則逐漸下降。推測(cè)的表達(dá)調(diào)控可能主要受到了其3′端組蛋白H3K4me3和H3K9ac修飾的影響,但還要作進(jìn)一步研究。除上述兩個(gè)區(qū)域外,在其啟動(dòng)子區(qū)以及基因的中間序列區(qū)并沒(méi)有檢測(cè)到上述3類組蛋白修飾的變化,表明組蛋白對(duì)該基因的修飾具有區(qū)域特異性,這種現(xiàn)象與和在擬南芥離體再生中的組蛋白修飾模式是相似的[14,16]。綜合上述分析,推測(cè)在蒺藜苜蓿離體再生過(guò)程胚性愈傷組織的建立中起著關(guān)鍵作用,且其表達(dá)激活受到了其特定區(qū)域的組蛋白H3K4me3和H3K9ac修飾的影響。

最近,Li等通過(guò)連續(xù)組織培養(yǎng)、再生馴化策略開發(fā)了一種高遺傳轉(zhuǎn)化效率的棉花新種質(zhì)Jin668[26]。進(jìn)一步利用多重組學(xué)研究手段解析了這一現(xiàn)象的表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)該棉花種質(zhì)再生能力的提高與多個(gè)體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因的低 (去) 甲基化修飾有關(guān)。外施DNA甲基化抑制劑增加了體細(xì)胞胚胎數(shù)量,激活了、、等基因表達(dá),促進(jìn)了體細(xì)胞胚胎的發(fā)生[26]。本研究中,我們證實(shí)了蒺藜苜蓿離體植株再生關(guān)鍵基因的組蛋白修飾調(diào)控基礎(chǔ),為提高蒺藜苜蓿植株再生效率提供了可行的策略,對(duì)于其他低再生效率豆科植物的基因工程改造途徑的優(yōu)化具有重要意義。

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Analysis of histone modification ofduringregeneration in

Wei Dong, Peixiang Wu, Xijiang Liu, Tianxue Gao, Ning Yang, and Yuguang Song

College of Life Sciences, Qufu Normal University, Qufu 273165, Shandong, China

Epigenetic modification, especially histone modification, plays an important role in maintaining plant genome stability, regulating gene expression and promoting regeneration.is an important marker gene involved in establishing of embryogenic callus duringregeneration of. In order to understand the regulation relationship between dynamic histone modification andexpression during the processes oforganogenesis, the expression ofwas analyzedby qRT-PCR, and the modification status of H3K9me2, H3K4me3 and H3K9ac in the promoter region and different regions included in the gene body was analyzed by chromatin immunoprecipitation (ChIP). We found expression activation ofwas related to the dynamic changes of histone H3K4me3 and H3K9ac in the 5′ and 3′ regions. This study will provide important theoretical guidance for understanding of the regulatory mechanism ofand also for establishing efficient genetic transformation system of.

, histone modification,, callus,organogenesis

June 21, 2018;

August 14, 2018

Natural Science Foundation of Shandong Province, China (No. ZR2015JL012), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31300220, 31501328), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2014M550366), Scientific Research Fund of Qufu Normal University (No. XKJ201320).

Yuguang Song. E-mail: SYG-0423@163.com

10.13345/j.cjb.180255

山東省自然科學(xué)基金 (No. ZR2015JL012),國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31300220,31501328),中國(guó)博士后基金(No. 2014M550366),曲阜師范大學(xué)科研基金(No. XKJ201320) 資助。

2018-08-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180827.0959.002.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)

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