胡會(huì)剛，趙巧麗，龐振才

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所農(nóng)業(yè)部熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524091）

菠蘿（Ananas comosus），又名鳳梨、黃梨，是一種多年生草本植物，系熱帶四大名果之一[1]，多汁，香甜，含有豐富的有機(jī)酸及維生素，具有生津止渴，清熱解毒，消食利尿，補(bǔ)益脾胃，潤(rùn)腸通便等功效[2]。17世紀(jì)在我國(guó)引種成功后，種植面積和產(chǎn)量逐年擴(kuò)大，2011年，我國(guó)菠蘿生產(chǎn)總面積達(dá)5.6萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量約119萬(wàn)噸[4]，現(xiàn)已成為世界十大菠蘿主產(chǎn)國(guó)之一[3]。在菠蘿生產(chǎn)加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量皮渣，占果實(shí)的15%～20%，大部分被直接丟棄，不僅造成資源浪費(fèi)，還加重了環(huán)境污染。研究表明，多糖是菠蘿皮渣中一類具有特殊生物活性的物質(zhì)，具有抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖[5]，提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能和抗病能力[6]，抗脂質(zhì)過(guò)氧化[7]，抗氧化[8]和抗腫瘤[9]等作用，目前已鑒定出來(lái)的成分有木糖、阿拉伯糖等。菠蘿皮渣多糖經(jīng)初提后常含大量雜質(zhì)，主要包括游離蛋白質(zhì)和色素等，不但影響多糖的純度和生物活性，而且給后期的色譜分析和結(jié)構(gòu)表征帶來(lái)很大困難[10]。因此，尋求一種除蛋白效果好、脫色率高、多糖損失少、對(duì)生物活性破壞小的菠蘿皮渣多糖脫蛋白和脫色工藝尤為重要。關(guān)于菠蘿皮渣多糖體外抗氧化活性的研究已有一些報(bào)道。羅建平等[11]發(fā)現(xiàn)，菠蘿皮渣多糖對(duì)O2-·和ABTS+自由基的清除率表現(xiàn)為顯著的量效關(guān)系，清除O2-·和ABTS+自由基的半抑制率（IC50）分別為1.76 mg/mL和2.49 mg/mL。王標(biāo)詩(shī)等[12]發(fā)現(xiàn)在濃度范圍（1.50 mg/mL～3.50 mg/mL）內(nèi)，菠蘿皮渣多糖對(duì)·OH、DPPH·均有良好的清除能力，對(duì)Fe3+的還原能力隨多糖濃度的增加呈良好的量效關(guān)系。但目前針對(duì)脫蛋白脫色后菠蘿皮渣多糖的抗氧化活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

基于此，本研究以脫蛋白率、脫色率和多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)不同脫蛋白方法的作用效果進(jìn)行了對(duì)比，并確定了活性炭法脫色的最佳工藝條件，進(jìn)一步對(duì)所得精多糖體外清除自由基能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，考察其作為天然抗氧化劑的應(yīng)用前景，以期為菠蘿皮渣精多糖在化妝品和醫(yī)藥制品方面的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿皮渣：購(gòu)自雷州市英利鎮(zhèn)紅土地菠蘿皮綜合利用廠；粉末活性炭：廣東韓研活性炭制造有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：美國(guó) Sigma公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）：Solarbio公司；葡萄糖：天津市福晨化學(xué)試劑廠；X-5大孔吸附樹(shù)脂：鄭州華溢科技新材料股份有限公司；聚酰胺：江蘇長(zhǎng)豐化工有限公司；濃硫酸：廉江市愛(ài)廉化試劑有限公司；無(wú)水乙醇、正丁醇、雙氧水、氯仿、丙酮、苯酚、三氯乙酸、鹽酸，均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；FD-1C-50型真空冷凍干燥機(jī)：上海喬躍電子有限公司；RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)海道爾夫公司；DHG 9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)：北京佳源興業(yè)科技有限公司；MAXQ800型恒溫?fù)u床：美國(guó)Thermo公司；EL 104電子天平：梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司；79-1型磁力攪拌器：新康醫(yī)療器械有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市英峪高科儀器；HH-4恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菠蘿皮渣粗多糖的制備

將新鮮、成熟的菠蘿皮渣烘干后用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。取一定量的菠蘿皮渣干粉，以1∶5 g/mL料液比加入80%無(wú)水乙醇，室溫?cái)嚢杞? h，抽濾棄去上清液，殘?jiān)?0℃烘干。以1∶30 g/mL料液比向脫脂物料中加入蒸餾水，于80℃超聲波清洗儀中，以160 W的功率浸提90 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘?jiān)貜?fù)提取1次。合并上清液，真空減壓濃縮至原體積1/10，加入濃縮液4倍體積95%乙醇，4℃靜置過(guò)夜。離心（4 000 r/min，10 min），沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3次，冷凍干燥即得菠蘿皮渣粗多糖。

1.3.2 菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白

1.3.2.1 鹽析法[13]

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液（5 mg/mL），置于小燒杯中，于磁力攪拌器上邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至設(shè)定的飽和度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，50℃攪拌30 min，冷卻至室溫后離心（4 000 r/min，20 min）去沉淀，收集上清液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.2 三氯乙酸法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，置于小燒杯中，加入20%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）至其終濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，30℃振蕩30 min，后將其轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中靜置12 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.3 Sevag法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，設(shè)置1～7次脫蛋白處理。每份多糖溶液中加入其體積1/4的Sevag試劑[氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1（體積比）]，混合振蕩 60 min（轉(zhuǎn)速180 r/min），4 000 r/min離心10 min，棄去下層有機(jī)相和中間層膠狀變性蛋白質(zhì)，取上層溶液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.4 TCA-正丁醇法[14]

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，加入2倍體積TCA-正丁醇混合溶液[TCA∶正丁醇=1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（體積比），TCA 濃度 20%]，30℃、185 r/min振蕩2 h，后將其轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置2 h，待分層后取下層溶液，分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.5 TCA-Sevag法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，按TCA法脫除一次，再用Sevag法脫除一次，分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.6 聚酰胺法

將聚酰胺用95%乙醇浸泡2 h后傾去乙醇，再用蒸餾水浸泡2 h，使其充分溶脹，超聲除去氣泡后備用。取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%溶脹好的聚酰胺，攪勻，室溫振蕩3 h，抽濾，取濾液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.7 酶法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，調(diào)節(jié)pH值為6.0，分別加入 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的木瓜蛋白酶，攪勻，60℃水浴振蕩水解3 h，沸水浴滅酶5 min，冷卻至室溫后4 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.3 菠蘿皮渣粗多糖脫色

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

采用活性炭對(duì)脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行脫色，分別探討活性炭添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間和樣液pH值對(duì)多糖溶液的脫色效果。單因素試驗(yàn)設(shè)定為：固定樣液pH值為6.0，脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為60 min，活性炭加入量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。固定樣液pH值為6.0，脫色時(shí)間為60 min，活性炭加入量為 2.5%，脫色溫度分別為 30、40、50、60℃；固定樣液pH值為6.0，活性炭加入量為2.5%，脫色溫度為 50 ℃，脫色時(shí)間分別為 20、40、60、80、100、120 min；固定活性炭加入量為2.5%，脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為 80 min，樣液 pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取活性炭添加量（A）、脫色溫度（B）、脫色時(shí)間（C）和樣液 pH 值（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，按L9（34）正交表安排試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 菠蘿皮渣精多糖體外抗氧化活性

1.3.4.1 DPPH·清除能力測(cè)定

將初步純化后的菠蘿皮渣粗多糖溶液經(jīng)蒸餾水透析2 d，濃縮醇沉，冷凍干燥制得菠蘿皮渣精多糖。取適量精多糖配制成質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的溶液，各取2 mL于不同具塞試管中，每管均加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度Ai。以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液測(cè)定吸光度Aj，以蒸餾水代替多糖溶液測(cè)定吸光度A0。以不同濃度VC溶液（0.1 mg/mL～3.0 mg/mL）作陽(yáng)性對(duì)照，以上試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ai為不同多糖濃度下的吸收度；Aj為不同濃度多糖溶液本底吸光度；A0為空白對(duì)照吸光度。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

各取50 μL不同質(zhì)量濃度的菠蘿皮渣精多糖溶液（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL），加入 4 mL ABTS+反應(yīng)液，混勻，避光反應(yīng)6 min，在732 nm處測(cè)定吸光度Ax，以甲醇作空白對(duì)照測(cè)定吸光度A0。以不同濃度VC溶液（0.1 mg/mL～3.0 mg/mL）作陽(yáng)性對(duì)照，以上試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。清除率計(jì)算公式如下：

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y1=0.011 0x1-0.000 2，R2=0.999 4。式中：x1為葡萄糖濃度，y1為吸光度。線性范圍為0～0.07 mg/mL。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y2=0.000 7x2+0.005 7，R2=0.999 6。式中：x2為蛋白質(zhì)含量，y2為吸光度。線性范圍為0～1.0 mg。

1.3.5.3 脫色率的測(cè)定

將經(jīng)脫蛋白后的菠蘿皮渣多糖溶液在波長(zhǎng)為200 nm～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明多糖溶液在323 nm下有最大吸收峰，故選擇323 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定菠蘿皮渣多糖溶液脫色前、后的吸光度。

1.3.6 計(jì)算公式

1.3.6.1 多糖保留率

1.3.6.2 脫蛋白率

1.3.6.3 脫色率

1.3.6.4 綜合指標(biāo)

比較蛋白質(zhì)和色素的脫除效果，要綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率（或脫色率）和多糖保留率兩方面的結(jié)果，本試驗(yàn)采用綜合評(píng)分作為蛋白質(zhì)和色素脫除效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，以指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，脫蛋白率（或脫色率）和多糖保留率的權(quán)重系數(shù)各為0.5。計(jì)算公式如下：

式中：X為脫蛋白率或脫色率；Y為多糖保留率，Xmax為蛋白質(zhì)或色素脫除率最大值；Ymax為多糖保留率最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白

2.1.1 鹽析法

硫酸銨粉末飽和度對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 硫酸銨粉末飽和度對(duì)脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.1 Effects of saturation of ammonium sulfate powder on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖1可知，隨著硫酸銨粉末飽和度的增加，多糖保留率持續(xù)降低，而蛋白質(zhì)脫除率呈先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)硫酸銨飽和度為70%時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最大，此時(shí)脫蛋白率為60.45%，多糖保留率為36.78%。硫酸銨飽和度低，蛋白質(zhì)沉淀不完全，蛋白質(zhì)脫除率較低；硫酸銨飽和度高，鹽的濃度高，所得沉淀多為蛋白酸銨，反而不利于蛋白質(zhì)的沉淀，且鹽濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)增加后續(xù)脫鹽難度及生產(chǎn)成本，同時(shí)多糖損失嚴(yán)重。綜合考慮脫蛋白率和多糖保留率，當(dāng)硫酸銨飽和度為10%時(shí)，評(píng)分值達(dá)到最大，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為33.55%，多糖保留率為80.79%。

2.1.2 三氯乙酸法

三氯乙酸濃度對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著TCA濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，而多糖保留率持續(xù)下降。TCA濃度較低時(shí)，其只能結(jié)合多糖中的一部分蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)脫除率低；隨著TCA濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，但TCA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成沉淀，會(huì)吸附部分多糖，導(dǎo)致多糖保留率降低[16]。綜合評(píng)價(jià)表明，當(dāng)TCA濃度為3%時(shí)評(píng)分值達(dá)到最大值，此時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為69.72%，多糖保留率為73.54%。

圖2 TCA濃度對(duì)脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.2 Effects of TCA concentration on deproteinization and polysaccharides retention rate

2.1.3 Sevag法

脫蛋白次數(shù)對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 脫蛋白次數(shù)對(duì)脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.3 Effects of deproteinization times on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖3可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)含量逐漸減少，用Sevag試劑處理1次，蛋白質(zhì)脫除率為11.36%，處理7次后，蛋白質(zhì)脫除率為48.18%。多糖保留率隨著脫蛋白次數(shù)的增加呈逐漸下降的趨勢(shì)，Sevag試劑處理1次時(shí)，多糖保留率為91.15%，處理7次后多糖保留率為76.31%。從綜合指標(biāo)來(lái)看，處理7次時(shí)評(píng)分達(dá)到最大值，表明用Sevag試劑處理多次后，蛋白質(zhì)脫除率明顯提高，但多糖損失較多，這可能是由于Sevag試劑在沉淀蛋白質(zhì)的同時(shí)造成多糖的損失[17]；此外，脫蛋白次數(shù)越多，重復(fù)操作過(guò)程也可能造成多糖的損失。

2.1.4 TCA-正丁醇法

TCA與正丁醇體積比對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 TCA與正丁醇體積比對(duì)脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.4 Effects of the volume of TCA and n-butanol on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖4可知，隨著TCA與正丁醇體積比的增大，蛋白質(zhì)脫除率呈先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)二者體積比為1∶10時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率和綜合評(píng)分值均達(dá)到最大值。此時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為81.47%，多糖保留率為85.91%。當(dāng)TCA與正丁醇體積比低于或高于1∶10時(shí)，多糖損失雖較少，但脫蛋白效果均不理想。

2.1.5 TCA-Sevag法

TCA-Sevag法脫蛋白次數(shù)對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 TCA-Sevag法脫蛋白次數(shù)對(duì)脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.5 Effects of TCA-Sevag deproteinization times on deproteinization and polysaccharides retention rate

如圖5可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，菠蘿皮渣粗多糖蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，連續(xù)操作2次后，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到83.17%，此后繼續(xù)增加重復(fù)操作次數(shù)，蛋白質(zhì)脫除率增大不顯著。多糖保留率隨著脫蛋白次數(shù)的增加逐漸降低，在重復(fù)操作3次后，多糖保留率為62.80%。綜合評(píng)價(jià)表明，重復(fù)操作4次后評(píng)分值達(dá)到最大，此時(shí)脫蛋白率和多糖保留率分別為86.86%和62.07%。

2.1.6 聚酰胺法

聚酰胺添加量對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 聚酰胺添加量對(duì)脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.6 Effects of the dosage of polyamide on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖6可知，隨著聚酰胺添加量的增大，菠蘿皮渣粗多糖溶液蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，而多糖保留率呈緩慢降低趨勢(shì)。當(dāng)聚酰胺添加量為2.0%時(shí)，綜合評(píng)分值達(dá)到最大，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為88.78%，多糖保留率為70.51%。

2.1.7 酶法

木瓜蛋白酶添加量對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 木瓜蛋白酶添加量對(duì)脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.7 Effects of the protease dosage on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖7可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，菠蘿皮渣粗多糖溶液的脫蛋白率逐漸增大，當(dāng)酶用量大于2.5%時(shí)，酶用量的增加對(duì)脫蛋白率無(wú)顯著影響，而多糖保留率隨著酶用量的增加呈緩慢降低趨勢(shì)。在底物量一定的條件下，增大酶用量，使底物與酶接觸的機(jī)會(huì)增大，反應(yīng)效率提高，脫蛋白率增大；但由于底物量有限，繼續(xù)增加酶用量不能使反應(yīng)效率持續(xù)升高[18]。綜合評(píng)分表明木瓜蛋白酶添加量為2.5%時(shí)評(píng)分值達(dá)到最大，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為30.49%，多糖保留率為88.15%。

2.1.8 脫蛋白方法的比較

7種脫蛋白方法對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 7種脫蛋白方法的比較Table 2 Comparison of seven deproteinization methods

由表2可知，聚酰胺法蛋白質(zhì)脫除率最高，但多糖保留率低于鹽析法、TCA-正丁醇法和酶法；TCA-正丁醇法的蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率均較高；鹽析法和酶法多糖損失雖較少，但蛋白質(zhì)脫除率均較低。綜合加權(quán)評(píng)分法分析表明TCA-正丁醇法的評(píng)分值最高，故后續(xù)試驗(yàn)采用TCA-正丁醇法對(duì)菠蘿皮渣粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理。

2.2 活性炭脫色工藝研究

2.2.1 活性炭添加量對(duì)脫色效果的影響

活性炭添加量對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖8。

圖8 活性炭添加量對(duì)脫色率和多糖保留率的影響Fig.8 Effects of amounts of active carbon on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖8可知，隨著活性炭添加量的增加，脫色率呈遞增趨勢(shì)，且差異顯著；多糖保留率隨著活性炭添加量的增加緩慢降低，這可能是由于活性炭加入量過(guò)大，對(duì)多糖產(chǎn)生少量吸附作用所致。為了保證脫色率和多糖保留率均在較高水平，選擇活性炭添加量為2.0%～3.0%來(lái)開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響

脫色溫度對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖9。

圖9 脫色溫度對(duì)脫色率和多糖保留率的影響Fig.9 Effects of decolorating temperature on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖9可知，隨著脫色溫度的升高，脫色率逐漸增大，當(dāng)脫色溫度為50℃時(shí)，脫色率達(dá)到最大，此后繼續(xù)延長(zhǎng)脫色溫度，脫色率增大不顯著。這可能是由于隨著溫度的升高，多糖溶液的黏度降低，色素分子運(yùn)動(dòng)加快，進(jìn)而加速了活性炭的吸附作用，直至吸附達(dá)到飽和[19]。多糖保留率隨脫色溫度的升高降低不顯著，說(shuō)明在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)多糖損失較少。綜合考慮，選擇脫色溫度為40℃～60℃來(lái)開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

脫色時(shí)間對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖10。

圖10 脫色時(shí)間對(duì)脫色率和多糖保留率的影響Fig.10 Effects of decolorating time on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖10可知，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率呈緩慢增大趨勢(shì)，當(dāng)脫色時(shí)間超過(guò)60 min后，脫色率增大不顯著，這可能是由于活性炭吸附已達(dá)到飽和，吸附與解析處于相對(duì)平衡。多糖保留率隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢降低，且降幅較小。綜合考慮脫色率和多糖保留率，選擇適宜的脫色時(shí)間為60 min～100 min。

2.2.4 樣液pH值對(duì)脫色效果的影響

樣液pH值對(duì)菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見(jiàn)圖11。

圖11 樣液pH值對(duì)脫色率和多糖保留率的影響Fig.11 Effects of pH value on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖11可知，樣液pH值在酸性或偏酸性環(huán)境中，脫色效果較好，在中性或偏堿性環(huán)境中，脫色率明顯降低，說(shuō)明活性炭在偏酸性條件下吸附作用較好。而多糖保留率隨樣液pH值的增大呈先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)樣液pH值為4.0時(shí)，多糖保留率達(dá)到最大。綜合考慮脫色率和多糖保留率，確定適宜的樣液pH值范圍為 3.0～5.0。

2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

續(xù)表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Analysis of variance and results of significance test

由表3和表4可知，影響活性炭脫色綜合評(píng)分的因素大小順序?yàn)椋篈＞D＞B＞C，即活性炭添加量對(duì)脫色效果影響最大，其次為樣液pH值，再者為脫色溫度，脫色時(shí)間對(duì)脫色效果影響最小?；钚蕴棵撋淖罴压に嚄l件為A3B3C2D2，即活性炭添加為量3.0%，脫色溫度為60℃，脫色時(shí)間為80 min，樣液pH值為4.0。按優(yōu)化的工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得脫色率為64.60%，多糖保留率為83.97%，表明試驗(yàn)優(yōu)化的最佳脫色工藝條件可靠。

2.3 菠蘿皮渣精多糖體外抗氧化活性分析

DPPH·能與抗氧化物提供的一個(gè)電子配對(duì)使其特征紫色消失，可根據(jù)其褪色程度來(lái)間接評(píng)價(jià)抗氧化物的抗氧化能力。菠蘿皮渣精多糖對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除效果見(jiàn)圖12。由圖12可知，菠蘿皮渣精多糖對(duì)DPPH·的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，在3.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到83.27%，略低于同濃度VC溶液的DPPH·清除率，說(shuō)明菠蘿皮渣精多糖具有良好的體外抗氧化能力。此外，菠蘿皮渣精多糖具有一定的清除ABTS+自由基的能力，隨著多糖濃度的增加，ABTS+自由基清除率也逐漸增大。當(dāng)濃度為3.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到49.12%，但低于同濃度VC溶液的ABTS+自由基清除率。

圖12 菠蘿皮渣精多糖對(duì)DPPH·和ABTS+自由基的清除效果Fig.12 Scavenging effects of polysaccharides from pineapple pomace on DPPH·and ABTS+radical

3 結(jié)論

本研究采用7種方法對(duì)菠蘿皮渣粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，結(jié)果表明TCA-正丁醇法的脫蛋白效果較好，其脫蛋白率為81.47%，多糖保留率為85.91%。采用活性炭對(duì)脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行脫色處理，分別考察了活性炭添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間和樣液pH值對(duì)脫色效果的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳脫色工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)因素對(duì)脫色效果的影響主次順序?yàn)椋夯钚蕴刻砑恿浚緲右簆H值＞脫色溫度＞脫色時(shí)間。適宜的脫色工藝為活性炭添加量3.0%，脫色溫度60℃，脫色時(shí)間80 min，樣液pH值4.0，在此條件下，脫色率為64.60%，多糖保留率為83.97%。經(jīng)初步純化制得的菠蘿皮渣精多糖對(duì)DPPH·和ABTS+自由基均有一定的清除作用，在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，清除率分別為83.27%和49.12%。由此可見(jiàn)，經(jīng)本研究篩選的脫蛋白、脫色方法切實(shí)可行，制得的菠蘿皮渣精多糖具有良好的抗氧化活性，可為菠蘿皮渣精多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。