周恒斌，劉雪蕊，張東星，李赫宇，於洪建，晏仁義，*

（1.浙江尖峰藥業(yè)有限公司，浙江金華321000；2.天津益倍元天然產(chǎn)物技術(shù)有限公司，天津300457）

枸杞，又名枸杞子、紅耳墜，是茄科植物枸杞的成熟果實(shí)，其味甘、性平、歸肝、腎精，具有益精明目、養(yǎng)陰潤肺、補(bǔ)虛益精等功效[1]。枸杞是一種藥食同源的物質(zhì)，營養(yǎng)較為豐富，主要含有枸杞多糖、類胡蘿卜素、甜菜堿等功效成分[2-4]?，F(xiàn)代研究表明，枸杞多糖具有重要的生理活性，已被證實(shí)由阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖6種中性糖及半乳糖醛酸等酸性糖組成[5-7]，具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗衰老、保肝護(hù)肝、調(diào)節(jié)血脂、降血糖等功效[8-10]。

隨著現(xiàn)代人保健意識的增強(qiáng)，枸杞作為藥食兩用原料市場知名度高、消費(fèi)量也大。據(jù)統(tǒng)計(jì)在已批準(zhǔn)的15 000余個保健食品中含枸杞或者枸杞多糖的有1 400多個，出現(xiàn)頻次位居第一位。以枸杞為核心原料的茶、膏滋、固體飲料類普通食品層出不窮?！吨袊幍洹芬澡坭蕉嗵呛吞鸩藟A含量作為指標(biāo)控制枸杞的質(zhì)量。關(guān)于枸杞多糖提取物沒有統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)[11]，目前，一般用苯酚-硫酸法測定多糖或者總糖的含量，由于枸杞本身糖含量較高，黏度較大，生產(chǎn)過程中不易干燥，商家可能會添加糊精類成分，而該方法不能區(qū)分是否添加糊精，導(dǎo)致添加糊精越多多糖含量越高，產(chǎn)品質(zhì)量越差的逆循環(huán)。關(guān)于糖的定性定量分析，常采用比色法[12]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13-14]、氣相色譜（gas chromatog raphy，GC）[15]等方法。本研究采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）衍生HPLC分析法，比較實(shí)驗(yàn)室自制和市售枸杞提取物單糖組成，測定酸性糖含量等。為枸杞提取物的質(zhì)量分析提供依據(jù)。同時，也為枸杞或者其提取物為核心原料的食品和保健食品的質(zhì)量控制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞子：產(chǎn)地為寧夏、山東等地（7個樣本，編號M1～M7，M7為青枸杞）；枸杞提取物：市售；D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、L-阿拉伯糖、D-木糖、乙腈（色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）：上海市試劑一廠；濃硫酸、三氯甲烷、氫氧化鈉、鹽酸、苯酚：均為分析純；水為天津益倍元天然產(chǎn)物技術(shù)有限公司自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SHIMDAZU LC-2030 3D高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器）：日本島津公司；752N紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；十萬分之一分析天平：瑞士Mettler-Toledo公司；TD2 4-WS離心機(jī)：湖南湘儀儀器有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋：天津特斯特儀器有限公司；DZF-6020真空干燥箱：上海博迅儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：密理博中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞單糖、多糖的提取

將枸杞子烘干，剪碎，稱取10 g枸杞子加入80%的乙醇150 mL回流1 h，趁熱過濾，提取3次，合并提取液減壓濃縮，置于60℃真空干燥箱中干燥，得到枸杞中的單糖和寡糖部位。將上述濾渣加入150 mL水，加熱回流2 h，趁熱過濾，減壓濃縮，加入4倍體積的乙醇（終濃度80%）醇沉，4℃靜置過夜，離心取沉淀，置于60℃真空干燥箱內(nèi)干燥，得枸杞粗多糖部位[16-18]。

1.3.2 糖組成分析

糖組成分析的步驟包括水解、PMP衍生化、HPLC分析等步驟，參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行試驗(yàn)[19-20]。

1.3.2.1 水解

準(zhǔn)確稱取烘干后的樣品10 mg，加水溶解，配置成濃度為10 mg/mL的溶液（市售枸杞提取物配置成5 mg/mL），吸取 100 μL 溶液于試管中，加入 70 μL 的2.5 mol/L H2SO4，110℃烘箱中水解2 h，取出冷卻后，加入 70 μL的5 mol/L的NaOH，漩渦混勻中和（未酸水解的樣品不經(jīng)硫酸處理，取溶液，直接進(jìn)行衍生化處理）。

1.3.2.2 PMP衍生化

上述水解液加入200 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液與100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，旋渦混勻，于70℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60 min，取出放置10 min冷卻置室溫，加入 100 μL 0.3 mol/L HCl中和，加入純水 1 mL，再加氯仿2 mL，重復(fù)萃取3次，取水相，過0.22 μm微孔過濾膜，得供試液。

1.3.2.3 HPLC分析

經(jīng)PMP衍生化處理好的樣品，過0.22 μm濾膜，按下述色譜條件進(jìn)行分析：色譜柱為ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相 A 為乙腈，流動相 B為 0.45 g KH2PO4、0.5 mL TEA、100 mL 乙腈、900 mL 高純水混合液（pH 7.5），梯度洗脫程序?yàn)?0～4 min，94%B；4 min～5 min，94%～88%B；5 min～50 min，88%B；流速1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積5μL，檢測波長250nm。

1.3.3 多糖含量測定

精確稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中，配置成1 mg/mL溶液，準(zhǔn)確吸取5 mL于50 mL容量瓶中，得0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取 0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mL 的 0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，用蒸餾水補(bǔ)足1mL，各加入6%的苯酚1.0 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，旋渦混勻，40℃水浴加熱30 min，冷卻，用分光光度計(jì)于490 nm下測定吸光值。枸杞樣品分別配置成0.1mg/mL溶液按此法測定糖含量。（市售枸杞提取物先用水溶解，80%乙醇沉淀過夜，收集沉淀，真空干燥后再測定糖含量）[21-22]。

1.3.4 酸性糖含量測定

精密稱取100 mg半乳糖醛酸于100 mL容量瓶中，用少量蒸餾水溶解，加入0.5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，蒸餾水定容至100 mL，搖勻，配置成濃度為1 mg/mL的半乳糖醛酸溶液。分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL容量瓶中，定容，分別配置成濃度為 20、40、60、80、100 mg/L的溶液。各吸取上述溶液1 mL，分別加入0.25 mL咔唑乙醇溶液，產(chǎn)生白色絮狀物，不斷搖動試管，快速加入濃硫酸5 mL，搖勻。立刻將試管放入85℃水浴鍋中水浴20 min，取出后放入冷水中迅速冷卻。1.5小時內(nèi)用分光光度計(jì)在525 nm下測定吸光值，以半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖部位的糖組成分析

實(shí)驗(yàn)室自制枸杞多糖均含有L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖和D-半乳糖醛酸，其中，成熟枸杞樣本M1～M5中L-阿拉伯糖與D-半乳糖所占比例較大；而樣本M6（與其他5種紅枸杞相比果實(shí)較硬，推測成熟度低）和樣本M7（青枸杞）中D-半乳糖醛酸所占比例較大，推測可能是未成熟枸杞中的果膠含量較高，隨著果實(shí)的成熟度增加，果膠會不斷分解，故青枸杞中半乳糖醛酸含量高于成熟后的紅枸杞。結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 7種混合標(biāo)準(zhǔn)糖溶液的液相色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of 7 standard sugars

圖2 成熟枸杞樣本多糖組成液相色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram of polysaccharide from mature wolfberry

圖3 樣品M6多糖組成液相色譜圖Fig.3 The HPLC chromatogram of polysaccharide from sample M6

圖4 樣品M7多糖組成液相色譜圖Fig.4 The HPLC chromatogram of polysaccharide from sample M7

2.2 單糖和寡糖部位的糖組成分析

處理方法按1.2.3，每個樣品分別按照酸水解后再衍生和不進(jìn)行酸水解直接衍生處理制作兩個樣本。成熟的枸杞（M1～M5）游離單糖主要為葡萄糖和甘露糖，兩者的比例約為10∶1；水解和不水解相比葡萄糖和甘露糖比例關(guān)系基本沒變化。未成熟樣本（M6和M7）游離單糖主要也為葡萄糖和甘露糖，但是和成熟樣本比峰面積小，并且葡萄糖和甘露糖的峰面積之間的比值也?。唤?jīng)酸水解后，葡萄糖的比例顯著提高，推測未成熟枸杞中含有較多的寡糖，見圖5～圖8。

2.3 市售枸杞提取物的分析

圖5 成熟枸杞樣品單糖和寡糖部位液相色譜圖（未酸水解）Fig.5 The HPLC chromatogram of mono-and oligosaccharides from mature wolfberry（no acid hydrolysis）

圖7 未成熟枸杞樣品單糖和寡糖部位液相色譜圖（未酸水解）Fig.7 The HPLC chromatogram of mono-and oligosaccharides from immature wolfberry（no acid hydrolysis）

圖8 未成熟枸杞樣品單糖和寡糖部位液相色譜圖（酸水解）Fig.8 The HPLC chromatogram of mono-and oligosaccharides from immature wolfberry（acid hydrolysis）

3份市售枸杞提取物（市售1～市售3）分別酸水解和未酸水解進(jìn)行糖組成分析，發(fā)現(xiàn)兩份枸杞提取物酸水解和未酸水解的色譜圖和糊精相應(yīng)圖譜基本一致。判斷枸杞提取物中添加了大量糊精。另外一份枸杞提取物在未酸水解條件下基沒看到糖的色譜峰，而在水解條件下的糖色譜峰和實(shí)驗(yàn)室自制枸杞多糖的色譜峰基本一致，因此推測該樣本為經(jīng)過醇沉淀處理過的真枸杞多糖提取物。見圖9～圖11。

2.4 多糖含量測定結(jié)果

采用苯酚-硫酸法，分別測定了10份樣本的多糖含量（實(shí)驗(yàn)室自制7份樣本，市售3份樣本），結(jié)果見表1。

實(shí)驗(yàn)室自制的枸杞多糖的含量（包括成熟枸杞與青枸杞）在32.09%～43.72%之間，而枸杞提取物的含量較高，在95%～98.04%。

2.5 枸杞多糖的酸性糖含量測定

采用咔唑-硫酸法分別測定了10個樣本中酸性糖的含量，結(jié)果見表1，枸杞多糖中半乳糖醛酸的含量在47.31～57.38%，枸杞多糖是一種酸性雜多糖。M6和M7酸性多糖的含量稍微偏高，與HPLC分析中半乳糖醛酸峰面積較大結(jié)果一致。

圖9 枸杞提取物（市售1）的液相色譜圖Fig.9 The HPLC chromatogram of wolfberry polysaccharide extract（commercial sample 1）

圖10 枸杞提取物（市售3）的液相色譜圖Fig.10 The HPLC chromatogram of wolfberry polysaccharide extract（commercial sample 3）

3 結(jié)論

本文采用PMP衍生化后經(jīng)HPLC分析糖的組成，7種自制枸杞多糖中均含有L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖6種中性單糖及酸性糖D-半乳糖醛酸，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。未成熟枸杞多糖中D-半乳糖醛酸的占比增大，酸性糖含量增加。成熟枸杞中單糖和寡糖部位主要為游離的葡萄糖和甘露糖，寡糖含量很少。未成熟枸杞中游離糖也為葡萄糖和甘露糖；游離糖含量少，寡糖含量較多。

圖11 糊精液相色譜圖Fig.11 The HPLC chromatogram of dextrin

表1 多糖和酸性糖含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of polysaccharide and acid polysaccharide

枸杞屬于漿果類物質(zhì)，提取液比較黏稠，不易干燥，吸濕性大。工業(yè)生產(chǎn)過程中會添加糊精類物質(zhì)改善性能。3份樣本中，從游離糖、單糖組成以及酸性糖含量和糊精是否一致3個角度分析，含枸杞的成分很少幾乎全是糊精。只有一份與實(shí)驗(yàn)室制備枸杞多糖的成分較一致，并且未檢測到游離糖的添加，推測是真正的枸杞多糖。多糖含量和酸性糖含量的角度也能反映出產(chǎn)品的品質(zhì)，如兩份疑似添加糊精的樣品多糖含量都大于90%，而真正枸杞多糖含量在32%～43%；相反，酸性糖含量在添加糊精后顯著降低。

目前市場上對枸杞多糖類產(chǎn)品的控制主要是測定多糖含量，甚至只測定總糖含量。這樣會產(chǎn)生一種添加糊精越多多糖含量越高，品質(zhì)越高的惡性循環(huán)。本結(jié)果為枸杞提取物的質(zhì)量控制提供了思路。通過PMP分析單糖組成，通過制定合理的多糖含量以及酸性糖含量控制枸杞提取物產(chǎn)品的控制。