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(1.上海海洋大學食品學院,上海 201406; 2.天津商業(yè)大學食品科學與生物技術(shù)學院,天津 300134; 3.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院,上海 200240)

我國關(guān)于鮮味的最早記錄是宋朝林洪在《山家清供》中記載竹筍“其味甚鮮”,現(xiàn)代是由池田菊苗于1908年發(fā)現(xiàn),并第一次提出了鮮味的概念[1],用來描述海藻提取物-谷氨酸鈉的味道。食品中的鮮味物質(zhì)包括氨基酸類、核苷酸類、小肽類、其他有機酸類和有機堿類。鮮味由味覺感受細胞上多種不同的鮮味受體傳感,主要包括mGluR4和mGluR1兩種親谷氨酸代謝受體與味覺受體異源二聚體T1R1/T1R3[2]。兩種代謝型鮮味受體主要發(fā)生在后舌,有助于其他口味的鮮味和化合物之間的辨別行為,異源二聚體T1R1/T1R3主要在舌前部的菌狀乳突和軟腭中共表達。味覺受體主要分布于味蕾組織上,將味覺信號傳遞到大腦從而感受到味道,達到控制飲食的目的。已有研究表明,鮮味受體不僅分布在味蕾中,還分布在身體的各個細胞、組織和器官中,特別是腸道系統(tǒng)中[3],表明鮮味受體具有其他功能。越來越多的證據(jù)表明味覺受體在人體內(nèi)消化和代謝調(diào)控過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4-5]。鮮味受體在腸黏膜內(nèi)分泌細胞中表達,與其他化學信號分子相協(xié)調(diào),調(diào)節(jié)能量和葡萄糖穩(wěn)態(tài)[6-7]。大量研究表明,分布在腸道系統(tǒng)中的味覺受體通過調(diào)節(jié)機體代謝與內(nèi)分泌系統(tǒng),吸收營養(yǎng),合成自身成分(如氨基酸),或通過交感-副交感神經(jīng)系統(tǒng)作用于下丘腦、腦垂體,調(diào)節(jié)機體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)[8-9]。

本實驗室前期對大鼠腸道組織的磷酸化蛋白組學研究表明,機體通過腸道控制代謝的基因主要在空腸的第二段表達。所以本研究就選用谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉和鳥苷酸二鈉這三種典型的鮮味物質(zhì)。選取空腸第二段黏膜組織為材料,制備電化學型組織傳感器,探討這3種鮮味物質(zhì)在空腸中與其相應(yīng)受體作用的動力學特性和參數(shù),推測鮮味受體與這些鮮味物質(zhì)的傳感、吸收、運轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Sprague Dawley(SD)大鼠 體重200 g左右,雄性，8～10周齡，天津市翔天科技有限公司；可溶性淀粉 天津市贏達稀貴化學試劑廠;海藻酸鈉 天津市光復精細化工研究所;戊二醛 天津博迪化工股份有限公司;核微孔膜 英國Whatman公司;CaCl2、CollagenaseⅡ、DispaseⅡ、谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉 美國Sigma公司;所有試劑 均為分析純;水為超純水。

LCQ分析天平 上海精密科學儀器有限公司;Millipore Milli-Q純水 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;KQ 3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LRH-70生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;CHI600E電化學工作站、三電極系統(tǒng)(玻碳電極(GCEΦ=3 mm)、參比電極-Ag/AgCl電極、對電極-鉑絲電極) 上海辰華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計方法 受體與配體相互結(jié)合,符合酶與底物相互作用的動力學曲線,即受體配體相互結(jié)合,隨著配體濃度的增大,通過電化學工作站而計算出的電流變化率為,先不斷增長,再趨于穩(wěn)定,即在受體未飽和的情況下,不斷與配體相結(jié)合,當飽和后,電流不再發(fā)生變化。

1.2.2 腸粘膜組織的制備 大鼠脫頸致死,用手術(shù)刀剖開腹部,取大鼠空腸組織第二段(從近十二指腸的空腸組織開始,以10 cm為一個段,取第二段),再用剪刀剪為三段,洗凈內(nèi)容物,用刀片將腸段剖開為平面,取0.25 cm2的腸粘膜平面置于生理鹽水中待用。

1.2.3 腸粘膜組織鮮味傳感器的制備 將1 g可溶性淀粉溶解于100 mL 1%的戊二醛水溶液中,80 ℃水浴加熱并攪拌30 min,配成一定質(zhì)量濃度的淀粉溶液,室溫下放置過夜,使淀粉與戊二醛得到充分的交聯(lián),獲到醛基化淀粉膠溶液。將2 g海藻酸鈉加入100 mL超純水中制成溶液,再與醛基化淀粉膠溶液1∶1混合[10-12]。取上述溶液10 μL,均勻涂抹于2張直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm聚碳酸酯微孔膜上,將準備好的0.25 cm2腸粘膜組織放置于一張微孔膜的圓心上,然后將另一張聚碳酸酯微膜覆蓋其上,制成三明治結(jié)構(gòu)的測定膜。將制成的腸粘膜組織膜浸入5 g/100 mL的CaCl2溶液中10 s后取出,使海藻酸鈉與CaCl2發(fā)生離子交換反應(yīng)形成穩(wěn)定的螯合物,凝膠化成良好的固定劑[13-14]。然后用生理鹽水沖洗腸粘膜組織膜(去除膜上存留的Cl-、Ca2+等)。最后,將腸粘膜組織膜固定在玻碳電極頭的表面,使得腸粘膜組織與表征完全的電極芯重合,制成鮮味生物傳感器。

1.2.4 鮮味生物傳感器對鮮味物質(zhì)的測定方法 采用三電極系統(tǒng),將固定好腸粘膜組織測定膜的玻碳電極作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,鉑絲電極作為對電極,以超純水為空白對照,-0.38 V,通過電流-時間測定法測定不同濃度(10-14～10-1mol/L)的谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉的響應(yīng)電流,以響應(yīng)電流的變化率作為檢測指標[15],響應(yīng)電流的變化率的計算公式為:

式(1)

式中:I1及I2分別表示鮮味物質(zhì)被測定前后同一時間點的穩(wěn)態(tài)電流值(A)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用chi660電化學工作站測定指定濃度范圍內(nèi)的穩(wěn)定電流值,再用excel表計算出如式1中的電流變化率,將這些值放入Orgin9軟件中,利用線性擬合曲線和非線形擬合曲線分別作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電流-時間測定法的電位優(yōu)化

制備好的傳感器在不同電位下(測試底液為超純水)用電流-時間法進行測定,以加入10-5mol/L的谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉前后穩(wěn)態(tài)電流差,來衡量不同電位對傳感器電化學響應(yīng)效果的影響,以電位的負值(-E)為橫坐標、電流前后變化率為縱坐標作圖。結(jié)果表明,在-0.38 V條件下電流的變化值最大,說明在此電流值下,鮮味物質(zhì)的響應(yīng)最明顯。故選定-0.38 V為恒電位進行鮮味生物傳感器對谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉響應(yīng)特性的研究。

2.2 鮮味配體與鮮味受體檢測范圍作用曲線

將固定化腸粘膜組織的電化學傳感器置于不同濃度的谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉從低濃度(10-14mol/L)到高濃度(10-1mol/L)作時間-電流法掃描,掃描電位選擇-0.38 V,使受體和配體充分結(jié)合后,選擇第90秒電流值作為穩(wěn)態(tài)電流,以電流在受體-配體結(jié)合前后的變化率ΔI與配體的濃度作圖。為便于作圖,以谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉濃度的對數(shù)值為橫坐標,響應(yīng)電流的變化率為縱坐標作圖,如圖1。

圖1 谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉在檢測范圍內(nèi)的電流變化率Fig.1 Current change rates of sodium glutamate,disodium inosinate,disodium guanylate in the detection range

由圖1可以看出:谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉電流變化率達到穩(wěn)定時的響應(yīng)范圍基本相同(基本都是在10-11mol/L達到穩(wěn)定),與動力學曲線與酶促反應(yīng)相似[16-18]。即在低配體濃度時,其信號輸出與配體濃度成正比;當配體濃度達到一定值時,信號輸出達到最大值;隨配體濃度的增加,信號輸出不再增加(如圖2)。由此,可以參照酶的動力學特性和參數(shù)對鮮味配體與其受體作用所產(chǎn)生的信號輸出進行動力學分析。

2.3 鮮味配體與受體作用引發(fā)的信號輸出動力學曲線

如圖1可看出谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉都在10-14～10-11mol/L的濃度范圍內(nèi),與響應(yīng)電流的變化率呈現(xiàn)良好的遞增關(guān)系。由此,在此范圍內(nèi),將三種鮮味物質(zhì)在10-14～10-11mol/L濃度進一步細分,以檢測的鮮味配體(谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉)的濃度為橫坐標、電流的變化率為縱坐標作圖,根據(jù)酶-底物結(jié)合動力學公式[16]:

[L]+[R]?[LR]?信號放大(輸出)

式(2)

[L]代表配體,[R]代表受體,上式表述為配體受體相互結(jié)合,產(chǎn)生信號,放大輸出。進行雙曲線擬合所得曲線如圖2。

根據(jù)Orgin9自帶的生成方程式方法可知,其擬合方程見表1:

表1 鮮味配體與受體作用雙曲線方程Table 1 Hyperbolic equation of the umami ligand and the receptor

由圖2可知,鮮味物質(zhì)(谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉)與其受體的作用曲線符合雙曲線,具有配體-受體飽和效應(yīng),與酶-底物作用動力學相似[16]。根據(jù)表1方程,分別以谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉濃度的倒數(shù)為橫坐標、以電流變化率的倒數(shù)為縱坐標作圖(即雙倒數(shù)法作圖)[17],得圖3。

圖3 谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉在10-14～10-11 mol/L濃度范圍內(nèi)與電流變化率的雙倒數(shù)法回歸曲線Fig.3 Double reciprocal regression curve of sodium glutamate,disodium inosinate,disodium guanylate in the concentration range of 10-14 mol/L to 10-11 mol/L

圖2 谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉濃度對電流變化率的雙曲線擬合圖Fig.2 Hyperbolic fitting of sodium glutamate,disodium inosinate and disodium guanylate on current rate of change

上述函數(shù)所擬合的線性回歸方程見表2:

表2 鮮味配體與受體作用線性回歸方程Table 2 Linear regression equation of the umami ligand and the receptor

由上可知R2都大于0.95,此擬合效果良好,此雙倒數(shù)法可靠。

2.4 鮮味受體與鮮味配體激活常數(shù)

根據(jù)研究結(jié)果我們根以及米氏方程[18]可計算得到:谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉與其受體相互作用的激活常數(shù)分別為:Ka=1.136×10-13mol/L,Kb=1.443×10-13mol/L,Kc=2.080×10-13mol/L。

即對大鼠空腸第二段而言,在這3種物質(zhì)之間,谷氨酸鈉的活性最高、肌苷酸二鈉第二、鳥苷酸二鈉最低。K越小,說明配體通過與受體作用產(chǎn)生的細胞信號輸出的效率越高。當所有細胞輸出信號都達到最大時,細胞上的受體(或結(jié)構(gòu)域)全部被飽和,因此該激活常數(shù)實質(zhì)上反映了平均每個細胞上能夠與配體結(jié)合的受體(或結(jié)構(gòu)域)數(shù)量,K越小,說明平均每個細胞上受體(或結(jié)構(gòu)域)數(shù)量越少。由此再計算平均每個腸粘膜細胞上鮮味受體的數(shù)目。

2.5 平均每個腸粘膜細胞上鮮味受體的數(shù)目

由2.4可計算受體數(shù)目,計算方法如下,如:當平均每個細胞上只有1個受體時,每個細胞就只有兩種狀態(tài):無信號放大作用的“0”和最大信號輸出“1”。

根據(jù)已有研究方法[19],定義每個細胞上的受體數(shù)量如下:

式(3)

其中:CM是細胞上受體個數(shù)不為1時,到達最大響應(yīng)信號的濃度;CL是細胞上只有1個受體時達到最大響應(yīng)信號的濃度(此研究中,CL的值為10-14mol/L)。

根據(jù)上述公式,結(jié)合2.4計算出的活性常數(shù),分別可得平均每個腸粘膜組織細胞上谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉的受體數(shù)量分別為:2.30、2.89、4.16/cell?？梢钥闯銎骄總€腸粘膜細胞上鳥苷酸二鈉的受體數(shù)量最多,其次為肌苷酸二鈉,最低為谷氨酸鈉。

2.6 對細胞信號級聯(lián)放大倍數(shù)的估算

為了能夠更準確估算配體與受體相互所產(chǎn)生的細胞信號放大作用,需要用裸電極在不同濃度(10-14～10-11mol/L)的配體溶液中所產(chǎn)生的電流響應(yīng)值作為對照,以排除裸電極的影響。以檢測溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標,以電流變化率為縱坐標,用oringin9作圖,并用直線擬合。谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉這三種鮮味配體與裸電極的作用方程見表3:

表3 鮮味物質(zhì)與裸電極作用方程Table 3 The equation of the umami substance and bare electrode

由式3得當濃度為K時所對應(yīng)的電流變化率。分別帶入表3的裸電極方程式可算出對應(yīng)裸電極的濃度,由此計算信號放大倍數(shù),結(jié)果見表4。

表4 鮮味物質(zhì)信號放大倍數(shù)Table 4 The umami substance signal amplification

由圖4可知,由信號放大倍數(shù)可以看出:N1>N2>N3,即谷氨酸鈉放大倍數(shù)最大,其次為肌苷酸二鈉,最低為鳥苷酸二鈉。此結(jié)果和上文所得到的活性常數(shù)和平均每個細胞上的受體數(shù)目相對應(yīng),說明配體與受體作用產(chǎn)生的信號輸出的效率越高,則信號放大倍數(shù)也越大,且此生物傳感器能在極低濃度的(10-14～10-11mol/L)配體溶液下,極大地放大信號倍數(shù),檢測閾值低,為在低濃度的配體溶液中識別并檢測鮮味物質(zhì)打下堅實的基礎(chǔ),這也從側(cè)面猜測:受體-配體互作所產(chǎn)生的生物活性主要取決于它們所引起胞內(nèi)信號的級聯(lián)放大作用,不同的配體所激活的和放大途徑不同。

圖4 工作電極(添加腸粘膜電極)與裸電極比較圖Fig.4 Working electrode(adding intestinal mucosa electrode) comparison of bare electrodes

3 結(jié)論

結(jié)果表明:激活常數(shù)K值鳥苷酸二鈉最大,其次為肌苷酸二鈉和谷氨酸鈉。信號輸出效率為谷氨酸鈉最高,肌苷酸二鈉第二,鳥苷酸二鈉最低。當輸出效率越高時,平均每個腸粘膜細胞上的效應(yīng)受體數(shù)目及信號放大倍數(shù)也越高。說明腸道對這四種鮮味物質(zhì)的傳感,實際上是通過激活細胞信號放大與傳遞來進行的。

機體對鮮味物質(zhì)的傳感不僅通過味覺系統(tǒng)進行食欲控制,更重要的是通過腸黏膜等復雜的受體系統(tǒng)進行傳感、吸收、運轉(zhuǎn)、儲藏、代謝與控制。本項研究結(jié)果表明:可以通過固定化腸黏膜組織所制備的生物傳感器進行動力學測定,通過激活常數(shù),平均每個腸粘膜細胞上的受體個數(shù),對細胞信號級聯(lián)放大倍數(shù)的估算,進一步揭示食品中的不同功能性成分如何通過腸黏膜受體發(fā)揮營養(yǎng)和代謝控制作用。該方法在食品營養(yǎng)、功能評價和藥物篩選等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。