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(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070; 2.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖北武漢 430075)

甜橙精油是由85%～99%的揮發(fā)性物質(zhì)和1%～15%的非揮發(fā)性物質(zhì)組成的,其中揮發(fā)性物質(zhì)主要由單萜類物質(zhì)和倍半萜烯類物質(zhì)及其氧化物構(gòu)成[1]。據(jù)報(bào)道,甜橙精油具有良好的抑菌作用[2-3],且其抑菌特性與高含量的揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān),尤其是檸檬烯[4]。Viuda-Martos等[5]利用瓊脂稀釋法研究四種柑橘精油對(duì)黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、疣孢青霉(Penicilliumverruculosum)和產(chǎn)黃青霉(PenicilliumChrysogenum)的抑菌作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柑橘精油對(duì)霉菌有較好的抑制作用。柑橘精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌,尤其是大腸桿菌(Escherichiacoli)的抑菌作用最顯著,其次為白色葡萄球菌(Staphylococcuscremoris),對(duì)青霉菌(Penicilliumsp)效果較弱[6]。植物精油的抑菌活性與精油的成分及所用的試驗(yàn)菌種有關(guān)[7],D-檸檬烯是甜橙精油中含量最高的成分,其含量高達(dá)70%以上[8-10]。李巧巧等[11]對(duì)商用柑橘精油和其主要成分D-檸檬烯對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和霉菌(Penicilliumsp.)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯的抑菌效果最好。柑橘精油不溶于水,易溶于有機(jī)溶劑,如果將其直接加入到食品或飲料中,低水溶性使其抑菌效果大大減弱,并出現(xiàn)分層現(xiàn)象,影響外觀。

然而,直接使用甜橙精油用于食品中腐敗菌的抑制存在很多限制,比如精油的水不溶性、不穩(wěn)定性及揮發(fā)性強(qiáng)等[12]。納米乳液(nanoemulsion)是一類粒徑大小為10～100 nm的膠體分散系統(tǒng)[13],主要由油、水、表面活性劑和助表面活性劑四種成分組成[14],具有大小均勻的透明或半透明、熱壓滅菌或高速離心穩(wěn)定的性質(zhì)[15],是動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定體系。因此,將甜橙精油制備成納米乳液可以克服直接使用精油存在的不足。此外,Kavas等[16]發(fā)現(xiàn)將甜橙精油添加于可食性膜中也能夠顯著增強(qiáng)其抑菌活性。

本文通過(guò)制備甜橙精油和D-檸檬烯納米乳液,采用抑菌圈法和最低抑菌濃度法研究甜橙精油和D-檸檬烯納米乳液對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)四種微生物的抑菌作用。并測(cè)定了甜橙精油和D-檸檬烯納米乳液的抑菌圈直徑及MIC,判定其抑菌性強(qiáng)弱。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

甜橙精油(Citrussinensis(L.)Osbeck) 取自秭歸縣屈姑食品有限公司;大腸桿菌ATCC25922(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003(Staphylococcusaureus)、桔青霉ATCC1109(Penicilliumcitrinum) 上海魯微科技有限公司;牛肉膏、麥芽浸粉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、吐溫80、瓊脂、氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠;D-檸檬烯(97%) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

LAS V4.5顯微鏡 德國(guó)徠卡公司;PB-10型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司;DH3600BII型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;KYC-100B恒溫?fù)u床振蕩器 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;LX-C35L型數(shù)顯型自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;Nano-ZS90型馬爾文激光粒徑儀 英國(guó)馬爾文公司;UV-1750紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液的制備 準(zhǔn)確稱取2.0 g甜橙精油和D-檸檬烯,分別并按劑油比(表面活性劑吐溫80與精油的比值=6∶4)在25 ℃下加入吐溫80 3.0 g,混合均勻,此溶液即為油相。助表面活性劑為無(wú)水乙醇,按表面活性劑(吐溫80)-助表面活性劑比例(Km)為7∶1(質(zhì)量比),稱取無(wú)水乙醇0.43 g,將無(wú)水乙醇與約5 mL去離子水混合均勻,然后加入0.01 g氯化鈉,混勻,然后再用去離子水將上述溶液定容至10 mL,此溶液即為水相。用玻棒逆時(shí)針均速緩慢攪拌油相,并以1.0 mL/min的速度向小燒杯中加入10 mL水相。最后放入攪拌轉(zhuǎn)子,置于磁力攪拌器上,轉(zhuǎn)速1500 r/min,攪拌6 h。注意攪拌速度不能太快,否則無(wú)法形成納米乳液。根據(jù)作者前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,在此溶液基礎(chǔ)上直接加入去離子水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、7.7%、11%、14%的甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液,用于甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液抑菌效果的測(cè)定。

1.2.2 納米乳液的形態(tài)觀察 取經(jīng)4000 r/min離心30 min后的約5 mL甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液樣品,用膠頭滴管滴一滴在載玻片上,蓋上蓋玻片,放在顯微鏡載物臺(tái)上于100倍油鏡下觀察樣品的各個(gè)部分,并攝制照片。

1.2.3 納米乳液粒徑測(cè)定 利用馬爾文激光粒徑儀在25 ℃下測(cè)量柑橘精油納米乳液粒徑。樣品用去離子水稀釋1000倍,以防止多次散射效應(yīng)。在塑料比色皿中加入甜橙精油納米乳液1 mL,插入樣品槽中,蓋上倉(cāng)蓋。設(shè)定測(cè)量波長(zhǎng)為658 nm,散射角173 °,平衡時(shí)間為60 s,間隔時(shí)間為10 s,軟件自動(dòng)記錄粒徑分組數(shù)據(jù)。根據(jù)粒徑和數(shù)目,繪制其分布圖。每個(gè)樣掃描三次,得平均值。

1.2.4 濁度及pH分析 采用紫外可見分光光度計(jì)在600 nm下測(cè)定甜橙精油納米乳液的OD值;用pH計(jì)測(cè)量甜橙精油納米乳的pH,以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 培養(yǎng)基的制備 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細(xì)菌培養(yǎng)基):牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,瓊脂1.5%～2%,加蒸餾水定容至1.0 L,調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4,在120 ℃的條件下滅菌30 min,冷卻后備用。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(真菌培養(yǎng)基):麥芽浸粉130 g,瓊脂1.5%～2%,加蒸餾水定容至1.0 L,pH為5.8～6.2,在120 ℃的條件下滅菌30 min,冷卻后備用。

1.2.6 菌懸液的制備 細(xì)菌懸濁液:細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面在37 ℃下活化24 h,待用。將經(jīng)活化的細(xì)菌從斜面上各挑取一環(huán),于生理鹽水中充分打散后,采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù),菌懸液濃度均調(diào)至106～107cfu/mL。

霉菌懸濁液:霉菌用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面在28 ℃下活化48 h,待用。將經(jīng)活化的霉菌從斜面上挑取一環(huán),于生理鹽水中充分打散后,經(jīng)顯微鏡直接計(jì)數(shù),霉菌孢子懸液濃度均調(diào)至106～107cfu/mL。

1.2.7 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 參考陳林林等[17]的方法,并稍作修改。配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,傾注于平板上,待其冷卻后移取0.1 mL菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面,用鑷子將三片直徑為6 mm的圓形濾紙片蘸取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、7.7%、11%、14%的甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液,以及甜橙精油及D-檸檬烯輕輕貼在培養(yǎng)皿中,濾紙片之間成正三角形分布,放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每個(gè)菌做三組平行。細(xì)菌培養(yǎng)24 h,真菌培養(yǎng)48 h,測(cè)定抑菌圈直徑,以最小抑菌圈直徑對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為該菌種的MIC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)由三次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到的各實(shí)驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏表示，并差采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行計(jì)算,使用SPSS Statistics 19進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米乳液的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1.1 納米乳液形態(tài)觀察及離心穩(wěn)定性 甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液在100倍油鏡下呈規(guī)則球形,分布較均勻,乳滴粒徑大多分布在10～20 nm之間(圖1)。離心后的甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液無(wú)渾濁、分層現(xiàn)象,透明、體系均一、性質(zhì)穩(wěn)定、流動(dòng)性好。

圖1 甜橙精油納米乳液(A)和D-檸檬烯納米乳液(B)的顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Microscopic structure of sweet orange essential oil nanoemulsion(A)and D-limonene nanoemulsion(B)

2.1.2 粒徑、濁度和pH分析 如表1所示,不同濃度的甜橙精油納米乳液在600 nm下的吸光值較小,pH變化范圍較小,說(shuō)明所制備的甜橙精油納米乳澄清透明、pH穩(wěn)定性好。本文制備的不同濃度甜橙精油的平均粒徑范圍在8.51～11.65 nm之間,Guerra-Rosas等[18]研究發(fā)現(xiàn)精油納米乳液的抑菌活性與精油的種類有密切關(guān)系,而與納米乳液的粒徑關(guān)系不大。

表1 不同濃度甜橙精油納米乳的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of sweet orange essential oil nanoemulsion with different concentrations

2.2 甜橙精油、D-檸檬烯及納米乳液的抑菌作用

由表2可知,甜橙精油和D-檸檬烯對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)都有較強(qiáng)的抑制作用。大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對(duì)甜橙精油和D-檸檬烯非常敏感,抑菌圈直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于15.0 mm。甜橙精油對(duì)金黃色葡萄球菌和桔青霉的抑菌圈直徑分別為13.0 mm和12.0 mm,屬于中度敏感,但D-檸檬烯對(duì)它們的抑菌圈直徑均為17.0 mm,屬于高度敏感?？傮w而言,D-檸檬烯的抑菌性優(yōu)于甜橙精油的抑菌性,且對(duì)細(xì)菌的抑菌效果要比霉菌好。然而,Torres-Alvarez等[19]發(fā)現(xiàn)去除部分檸檬烯的濃縮甜橙精油的抑菌活性比未濃縮精油及D-檸檬烯的抑菌活性強(qiáng),這說(shuō)明甜橙精油中的其他成分也具有一定的抑菌活性,比如檸檬醛、α-松油醇、α-香茅醛等含氧化合物[20]。Eldahshan等[21]發(fā)現(xiàn)不同組織部位的甜橙精油的抑菌活性也存在差異。

最低抑菌濃度(MIC)指在一定條件下能夠抑制微生物生長(zhǎng)的最低抑菌劑濃度,不同條件下的MIC也不同[22]。結(jié)合表2可知,與甜橙精油納米乳液相比,D-檸檬烯納米乳液有更強(qiáng)的抑菌效果,這和李巧巧等[11]研究的商用柑橘精油和D-檸檬烯的抑菌作用結(jié)果一致。另外,甜橙精油納米乳液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌作用最強(qiáng),其次為大腸桿菌(Escherichiacoli),對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)的抑菌作用較弱。陳林林等[6]在研究柑橘皮油抑菌活性時(shí),發(fā)現(xiàn)其對(duì)多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有較好的抑菌性,對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)效果最好,其次為白色葡萄球菌(Staphylococcuscremoris),對(duì)青霉菌的抑制作用并不顯著。

表2 不同濃度甜橙精油納米乳液、D-檸檬烯納米乳液和甜橙精油、D-檸檬烯的抑菌性Table 2 Antibacterial effects of different concentrations of sweet orange essential oil nanoemulsions,D-limonene nanoemulsions,orange essential oil and D-limonene

甜橙精油納米乳液濃度為4%和7.7%時(shí),對(duì)大腸桿菌沒有抑制作用;濃度為11%時(shí),抑菌圈直徑為8.7 mm;濃度為14%時(shí),抑菌圈直徑為11.7 mm。不同濃度的D-檸檬烯納米乳液對(duì)大腸桿菌均具有抑菌作用,抑菌圈直徑由最低濃度(4%)時(shí)的10.0 mm升至最高濃度(14%)時(shí)的19.0 mm。對(duì)于枯草芽孢桿菌,甜橙精油納米乳液濃度為4%時(shí)沒有抑菌作用;濃度為7.7%時(shí),抑菌圈直徑為6.7 mm;濃度為14%時(shí),最大抑菌圈直徑為14.0 mm。不同濃度的D-檸檬烯納米乳液對(duì)枯草芽孢桿菌均具有抑菌作用,抑菌圈直徑由最低濃度(4%)時(shí)的11.0 mm升至最高濃度(14%)時(shí)的23.7 mm。對(duì)于金黃色葡萄球菌,甜橙精油納米乳液濃度為4%和7.7%時(shí)沒有抑菌作用;濃度為11%時(shí),抑菌圈直徑為7.0 mm;濃度為14%時(shí),抑菌圈直徑為9.7 mm。李巧巧等[15]研究發(fā)現(xiàn)檸檬精油、橙子精油、柚子精油等柑橘精油對(duì)細(xì)菌、酵母菌、霉菌都有抑菌作用,其中D-檸檬烯的抑菌效果最優(yōu),這和本文結(jié)果一致。

不同濃度的D-檸檬烯納米乳液對(duì)金黃色葡萄球菌均具有抑菌作用,抑菌圈直徑由最低濃度(4%)時(shí)的8.0 mm升至最高濃度(14%)時(shí)的13.0 mm。對(duì)于桔青霉,甜橙精油納米乳液濃度為4%和7.7%時(shí)沒有抑菌作用;濃度為11%時(shí),抑菌圈直徑為6.7 mm;濃度為14%時(shí),抑菌圈直徑為9.0 mm。4%和7.7%的D-檸檬烯納米乳液對(duì)桔青霉沒有抑菌作用,濃度為11%時(shí)抑菌圈直徑為6.7 mm;濃度為14%時(shí)抑菌圈直徑為12.0 mm。李婭男[23]發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯納米乳液對(duì)于釀酒酵母的抑菌效果最佳,對(duì)于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌也非常敏感,但對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌效果較差。陳琳琳等[6]研究柑橘精油抑菌活性發(fā)現(xiàn),大腸桿菌和葡萄球菌對(duì)柑橘精油高度敏感,抑菌圈直徑大于15.0 mm,青霉對(duì)柑橘精油中度敏感,抑菌圈直徑為14.1 mm。Fisher等[24]研究檸檬烯對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等細(xì)菌的抑菌性,發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌等沒有抑菌作用。

因此,甜橙精油納米乳液對(duì)大腸桿菌的MIC介于7.7%～11%之間;對(duì)枯草芽孢桿菌約為7.7%;對(duì)金黃色葡萄球菌約為11%;對(duì)青霉約為11%。邢旭亞[25]通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)供試菌種經(jīng)過(guò)用MIC制備的Nisin及D-檸檬烯復(fù)合油凝膠納米乳處理3 h后,菌體細(xì)胞遭到嚴(yán)重的破壞和變形,這說(shuō)明了納米乳液體系可增大菌體細(xì)胞膜的通透性,使膜結(jié)構(gòu)受到不可修復(fù)的破壞。Sugumar等[26]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)甜橙精油納米乳處理的微生物細(xì)胞在30 min內(nèi)就失去了生存能力。

3 結(jié)論

利用相轉(zhuǎn)變點(diǎn)法制備甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液,采用抑菌圈法和最低抑菌濃度法研究甜橙精油納米乳液及其主要成分D-檸檬烯納米乳液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和桔青霉的抑菌作用,得到結(jié)果如下:甜橙精油納米乳液和D-檸檬烯納米乳液均具有良好的抑菌作用,且D-檸檬烯納米乳液抑菌效果比甜橙精油納米乳液的抑菌效果好。甜橙精油納米乳液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌作用最強(qiáng),其MIC最小,對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和桔青霉的抑菌作用較弱,其MIC較大,抑菌圈直徑分別為8.7、7、6.7 mm。甜橙精油納米乳液對(duì)各個(gè)菌種的MIC不一樣,枯草芽孢桿菌的MIC約為7.7%;其次為大腸桿菌,其MIC介于7.7%～11%之間;對(duì)金黃色葡萄球菌和桔青霉抑制作用較弱,均約為11%。