, ,,,,*

(1.華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006; 2.廣東檢驗檢疫技術中心 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623)

古書《五燈會元》中有“懸羊頭,賣狗肉”一說,原以此借喻表里不一,但在食品安全中,卻屢屢出現(xiàn)真實的掛羊頭賣狗肉事件,現(xiàn)今世界各國每年都會有許多肉類摻假事件被曝光:2013年初的歐洲馬肉風波;2013年末的沃爾瑪超市狐貍?cè)鈸郊偈录?2015年初“憶思”牌牛肉干事件等等。這些食品摻假事件被統(tǒng)稱為“經(jīng)濟利益驅(qū)動的摻假”(Economically Motivated Adulteration,EMA)。

從2013年開始,我國就穩(wěn)居世界第一大肉類生產(chǎn)國,年產(chǎn)量逐年上漲,國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示2017年豬牛羊禽肉產(chǎn)量8431萬噸。我國肉類生產(chǎn)成本高導致各種肉類的價格高、差異大,市場中存在大量低價肉冒充高價肉,非食用肉冒充食用肉的現(xiàn)象。據(jù)新發(fā)地批發(fā)市場報價,禽類與豬肉,豬肉與牛、羊肉有幾倍的差價,這種高額的利潤使得不法分子鋌而走險,食品摻假屢禁不止。2013年,我國部分地區(qū)開展了肉及其制品的摻假情況調(diào)查,結(jié)果顯示有25.6%的樣品與標識不符。這些違法行為不僅侵害了人民的合法權益、損害了人民的身體健康,而且當豬肉制品摻入到清真食品中造成的惡劣影響會引發(fā)宗教事件,不利于社會的和諧穩(wěn)定。

由于監(jiān)管需求,各種動物物種檢測技術相繼被開發(fā)出來。最初檢驗人員使用顯微鏡識別區(qū)分不同物種,以發(fā)現(xiàn)造假行為,后來科學家又開發(fā)出基于蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的檢測方法,主要包括光譜學方法、免疫學方法、色譜和質(zhì)譜技術,然而這些方法技術都存在著各種弊端,光譜學方法需要建立復雜的模型,但模型不具有通用性;免疫學方法的靈敏度偏低,存在較多的假陽性結(jié)果;色譜和質(zhì)譜技術對儀器設備的要求比較高,并且容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果,因此這些方法不能很好的滿足監(jiān)管的需求。在過去二十年里,基于核酸的分子生物學技術發(fā)展迅猛,因為核酸存在于大多數(shù)細胞中,其結(jié)構(gòu)保守,高溫下具有更好的穩(wěn)定性。所以隨著分子生物學檢測技術的蓬勃發(fā)展,使得肉類物種鑒別有了真正可靠的方法技術。

本文主要對禽畜魚的原料肉及加工肉制品的七種分子生物學摻假鑒別方法的研究進展進行介紹和分析,并對未來的研究方向進行了探討和展望。

1 常規(guī)PCR方法

PCR是一種生物體外的聚合鏈式擴增反應,可以在幾小時內(nèi)通過引物和酶對特定的核酸序列進行數(shù)百萬次擴增。這種技術由Mullis等[1]發(fā)明。常規(guī)PCR方法的原理是經(jīng)PCR擴增特異性片段后,利用瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳后的結(jié)果,根據(jù)陰陽性或片段大小以鑒定區(qū)分不同物種。已經(jīng)成為肉類摻假檢驗領域的常規(guī)技術方法,得到了廣泛的應用。

Cunningham等[2]證明PCR方法在活體動物和動物制品的檢測上很有幫助。Herman等[3]采用細胞色素b序列設計引物,成功的檢測出食品中的雞、火雞、豬、牛、綿羊成分。Piknova等[4]也利用細胞色素b序列檢測出食品中的牛成分。Montiel等[5]設計了基于D環(huán)區(qū)的引物,可以在腌制或熱加工食品中擴增出531 bp的DNA序列,以此來鑒別豬肉。他們還通過簡單的AvaII分析來分辨野豬和家豬。Calvo等[6]設計了豬的特異性引物,在豬的生熟肉、香腸、煙熏肉、餡餅等各種加工品中成功的檢測出了豬肉。這個方法也用在了生熟牛肉和鴨肉中豬肉的檢測。Arslan等[7]設計實驗測定了不同加工方法對于線粒體DNA的PCR擴增的效果的影響,在煮、烤、高壓和煎等烹飪方法中,除煎制80 min后的樣品,其余加工后樣品均檢測出牛源性成分。這些科學家的實驗結(jié)論說明了DNA在高溫高壓加工處理后仍具備PCR擴增的能力,也證明了PCR方法可以應用于加工肉制品的檢測中。Ilhak等[8]采用一種鑒別的新思路,通過PCR擴增馬、狗、貓、牛、綿羊、豬和山羊,最終產(chǎn)物分別為439、322、274、271、225、212、157 bp,觀察瓊脂糖凝膠電泳中片段的大小,最低可以鑒定出混合肉中0.1%含量的摻假成分。Kesmen等[9]開發(fā)了一種高效的特異性PCR方法,利用線粒體DNA設計引物,可以檢測出香腸中低含量的豬肉、馬肉和驢肉,最低可檢測0.01 ng的目標DNA。當使用混合肉樣進行檢測時,可以檢測出低至0.1%含量的物種源性成分。常規(guī)的PCR方法的應用開創(chuàng)了物種鑒別的PCR時代,由于常規(guī)PCR方法一次只能檢測一種物種,局限性大,科學家又在此基礎上開發(fā)了其他新型PCR方法。

2 多重PCR方法

多重PCR方法是將多個引物對用在一個PCR反應體系中,利用一個模板反應可以得到多個擴增片段。利用此方法,在一次PCR反應中使用基于細胞核DNA和線粒體DNA的多個引物對,可以精確檢測多種物種成分。

Fei等[10]利用D環(huán)區(qū)設計引物,通過多重PCR反應可以一次性鑒定牛肉、豬肉和雞肉。Behrens等[11]利用多重PCR對復雜樣品中的雞肉、火雞肉、牛肉、豬肉、山羊肉、驢肉和馬肉進行區(qū)分鑒定,其中加工后樣品的最低檢測限為1%。Yin等[12]使用12S rRNA基因序列,設計了三對引物,利用多重PCR方法,對牦牛肉和牛肉進行鑒別,牛肉的PCR反應產(chǎn)物有兩種片段,大小分別為290、159 bp,而牦牛肉的PCR反應產(chǎn)物只有一種片段,大小為290 bp。利用這種方法,可以對牦牛和牛的混合生肉和混合熟肉進行區(qū)分鑒定,得到了很好的效果,其中牛肉的檢測低限在0.1%。張全芳等[13]利用16S rRNA序列的差異,設計引物,進行多重PCR可以成功區(qū)分綿羊、山羊和狐貍。多重PCR依據(jù)不同的需要從最初的雙重PCR發(fā)展為四重PCR[14]、五重PCR[15-16]和六重PCR[17-18]甚至七重PCR[19-20],同時檢測的物種數(shù)量逐步增多。多重PCR技術完美繼承了常規(guī)PCR的優(yōu)點,又可以在同一次反應中檢測多個物種,大大節(jié)約了實驗成本。

3 限制性片段長度多態(tài)性PCR方法

限制性片段長度多態(tài)性PCR方法是利用常規(guī)PCR方法擴增出目標片段,然后將產(chǎn)物用特異性內(nèi)切酶消化切割為不同長度的片段,最后通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳等方法,觀察分析電泳結(jié)果得出結(jié)論。

Ali等[21]利用豬的細胞色素B基因設計引物,進行限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析,能夠成功的檢測到0.0001 ng的純豬肉,并且可以在豬肉、牛肉和小麥的混合物中檢測出豬源性成分,最低檢測限可達0.01%。Ong等[22]利用細胞色素B基因,經(jīng)過一輪PCR反應后,分別使用不同的內(nèi)切酶處理PCR產(chǎn)物,豬肉產(chǎn)物可以分別被AluI和BsaI切割成兩個片段,雞肉產(chǎn)物可以被RsaI切割成兩個片段,牛肉產(chǎn)物可以被AluI切割為三個片段,被BsaI切割成兩個片段,這些片段的大小均不相同,利用瓊脂糖凝膠電泳可以清晰觀察并得出模板的動物種類,一輪PCR反應可以分辨多種物種,節(jié)約了成本。Sun等[23]在PCR反應中加入R6G dCTP,生成帶有熒光信號的產(chǎn)物,酶切后利用毛細管電泳分析,可以在肉類混合物中分別檢測出低于1%含量的豬、羊和牛源性成分,并且烹飪和高壓處理不會影響檢測的準確性。Yuny等[24]利用RFLP方法對印尼地區(qū)的部分牛肉丸進行了檢測,發(fā)現(xiàn)了一些牛肉丸中有豬肉的陽性信號,證明了RFLP方法在實際監(jiān)管過程中能夠起到檢測的作用。RFLP方法雖然有著很好的檢測效果,但是其可重復性偏低,易受到內(nèi)切酶的影響,并且比常規(guī)PCR方法復雜,實驗成本高,因此在實際監(jiān)管中應用較少。

4 DNA分子雜交方法與基因芯片技術

DNA分子雜交檢測技術是將生物體內(nèi)的DNA雙鏈變性為DNA單鏈,人為添加帶有熒光或同位素的互補鏈,如果兩者之間形成堿基互補,那么會檢測到陽性信號。

這種技術在1987年第一次應用于肉類檢測中[25],Buntjer等[26]建立了牛、羊、馬、雞、豬等多種物種的分子雜交檢驗方法,在混合肉中可以檢測到最低1%的動物源性成分,在4 h內(nèi)可以檢測50種樣品,并且對于熱加工的樣品依然具有很好的檢測效果。Buntjer等[27]對加工肉制品作為樣品的DNA雜交進行了研究,發(fā)現(xiàn)肉的冷凍與解凍過程不會影響DNA雜交的效果,而100、120 ℃的高溫處理可能會導致DNA的降解,但是不會影響最終的物種鑒別。DNA雜交技術作為一種基礎的檢測技術,存在有耗時長,靈敏度低等許多缺陷,所以科學家發(fā)明了一些基于DNA雜交原理的改進版新型檢測技術[28]。

基因芯片技術是基于DNA分子雜交原理的新型檢測技術,其將大量的探針序列固定在支持物上面,可以實現(xiàn)對樣品快速方便的檢測。朱業(yè)培等[29]建立了一種可以同時檢測牛、羊、豬、馬、鹿和兔6種物種源性的基因芯片,牛源性成分和馬源性成分的相對檢測低限達到了0.001%。Kochzius等[30]開發(fā)了一種含有64個探針的基因芯片,利用一張芯片可以同時檢測30種不同的魚類。DNA芯片技術結(jié)合了PCR和DNA雜交的優(yōu)點,逐漸得到監(jiān)管部門和食品行業(yè)的重視。目前采用DNA芯片技術的國家標準檢測方法《常見動物源性成分快速測定 膜芯片法 GB/T 35917-2018》已經(jīng)起草即將于2018年9月1日實施。隨著國家標準的即將實施,此方法將越來越多的應用于實際檢驗中。

5 實時熒光PCR方法

實時熒光PCR方法是在常規(guī)的PCR體系中添加熒光基團,利用機器監(jiān)測熒光信號的變化,可以實時監(jiān)控PCR反應過程,以實現(xiàn)對樣品的定性和相對定量。在物種鑒別中,熒光PCR方法是比較先進的技術,結(jié)果直觀易觀察,避免了瓊脂糖凝膠電泳中的污染問題。

Wolf和Jurg[31]使用基于生長激素基因設計的引物,對豬肉進行鑒定,即使樣品在115 ℃中加熱2 h,使用熒光PCR方法在樣品中也可以檢測到低至0.1%含量的豬肉。科學家利用實時熒光PCR研發(fā)了多種定量方法。Mendozaromero等[32]實現(xiàn)了基于實時熒光PCR方法的反芻動物的相對定量,能夠最低檢測到10 tg的牛DNA。Kim等[33]利用D環(huán)區(qū)設計引物,可以最低檢測出0.1 pg的豬DNA。Xiang等[34]從細胞核DNA中找到了細胞骨架肌動蛋白基因,并驗證了其特異性,定量檢測限為10 pg。Druml等[35]開發(fā)了鹿的熒光PCR方法,在混合肉的實驗中效果良好,定量限小于0.5%。Furutani等[36]利用特制的便攜式熒光PCR裝置,可以在16 min內(nèi)完成45個循環(huán)的熒光PCR反應,準確高效的檢測出食品中的豬、牛、雞等物種。這個方法一定程度解決了監(jiān)管部門在現(xiàn)場快速檢驗的需求。劉艷艷等[37]將多重PCR與實時熒光PCR結(jié)合起來,綜合利用細胞核DNA和線粒體DNA設計了三對引物和五種探針,采用多重熒光PCR方法在一輪PCR中可以同時區(qū)分出驢肉、馬肉和騾肉。實時熒光定性PCR是現(xiàn)在肉類鑒定中最主要的方法之一,其相關標準和檢測方法眾多。

6 數(shù)字PCR方法

數(shù)字PCR技術誕生于1999年,2003年發(fā)明了BEAMing技術[38],在此基礎上于2006年發(fā)明了基于芯片法的數(shù)字PCR儀,2011年發(fā)明了基于微滴法的數(shù)字PCR儀[39]。數(shù)字PCR將基因樣品分散到大量的獨立反應空間中,每個空間中含有大約一個基因拷貝,利用模板特異性引物探針來檢測PCR的最終產(chǎn)物,在對所有空間進行PCR反應后,利用計數(shù)器測量PCR產(chǎn)物的熒光強度,通過泊松統(tǒng)計分析得到數(shù)據(jù)?，F(xiàn)在主要有兩種數(shù)字PCR技術:芯片式數(shù)字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。與實時熒光PCR的相對定量所不同,利用數(shù)字PCR反應可以對樣品進行絕對定量分析,消除本底信號的干擾。Scollo等[40]對數(shù)字PCR和實時熒光PCR進行了對比實驗,發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR具有更好的分辨率。

Floren等[41]利用基因組DNA與線粒體DNA分別設計的引物探針進行動物源性成分的定量檢測,通過實驗發(fā)現(xiàn)線粒體DNA在不同的細胞組織中含量分布不均勻,不適用于定量分析,而基因組DNA在不同的細胞組織中含量恒定,適用于定量分析。因此針對數(shù)字PCR的定量需求,需要對不同物種開發(fā)基于基因組DNA的新引物探針。苗麗等[42]利用單拷貝基因?qū)悠分械难蜻M行定量分析,成功建立了拷貝數(shù)與DNA濃度,DNA濃度與樣品質(zhì)量的關系式,可以達到絕對定量的要求,檢測低限達到10%。任君安等[43]利用數(shù)字PCR測得羊與豬的拷貝數(shù)比率,并與實際樣品中,羊和豬的質(zhì)量比率進行對比,發(fā)現(xiàn)可以最低檢測出1%的豬肉。數(shù)字PCR作為一種新型PCR方法,在定量應用中有著廣闊的前景,可以區(qū)分有意摻假和無意沾染。對于深加工的肉制品理論上可以做到精確定量,滿足監(jiān)管的需求。表1總結(jié)了國內(nèi)外利用數(shù)字PCR對肉制品檢測的現(xiàn)狀。

表1 數(shù)字PCR對肉制品檢測的定量限Table 1 Limit in meat adulteration detection by digital PCR

7 DNA條形碼技術

現(xiàn)今的大多數(shù)檢測方法并沒有實現(xiàn)系統(tǒng)性和標準化,不同監(jiān)管部門可能使用不同的基因來鑒別同一種物種,這不利于監(jiān)管的科學化管理。加拿大科學家Hebert[49]于2003年提出了DNA條形碼技術。DNA條形碼技術是一種利用短的DNA序列對物種進行鑒別的技術,現(xiàn)今大部分動物采用COI基因作為條形碼標準片段[50]。李新光等[51]利用DNA條形碼技術對15種烤魚片進行鑒定,發(fā)現(xiàn)僅有一種烤魚片與包裝標識相符,因此市場中存在大量的造假行為。Cardeosa等[52]在廣州的市場上采購了200種鯊魚魚鰭,這些魚鰭中只有0.5%含有完整的COI序列,但是最終利用DNA條形碼技術仍然能夠成功鑒別其中的170種魚鰭的種屬,其余30種由于其擴增產(chǎn)物質(zhì)量較差,導致了鑒別的失敗。Vartak等[53]利用DNA條形碼技術對11種食用蟹進行了成功的鑒別,發(fā)現(xiàn)在抽查的50份蟹肉樣品中,全部出現(xiàn)樣品與標識不符,造假比率達到100%。DNA條形碼技術作為一種新型檢測技術,對于監(jiān)管的標準化起到了重要的作用。現(xiàn)在的研究主要在水產(chǎn)品方向,仍然需要在禽畜等方向進行大量的研究。

8 結(jié)論與展望

目前,分子生物學檢測方法在肉類和肉制品的物種鑒定中得到廣泛的應用。分子生物學檢測方法相比其他檢測方法有著巨大的優(yōu)勢:核酸相比蛋白質(zhì)要更加穩(wěn)定;核酸在生物體內(nèi)大量存在,分布均勻;基于核酸方法的檢測成本更低、精確度更高;核酸在不同物種間具有更高的特異性。由于其他方法具有非常多的局限性,而分子生物學檢測的方法具有適用廣、精度高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點。因此分子生物學方法現(xiàn)在已經(jīng)逐漸成為物種鑒別領域的主要檢測方法。

在這些分子生物學檢測方法中,常規(guī)PCR和多重PCR方法是分子生物學檢測中最基礎的方法。RFLP方法具有較好的檢測效果,但可重復性差,因此較少應用于實際檢測。DNA雜交技術存在有耗時長,靈敏度低等許多缺陷,因此較少應用于實際檢測。目前實時熒光PCR方法逐漸成為了監(jiān)管應用中的主角,其具有高效直觀靈敏度高的特點。但是這種方法也有一些不足之處,主要體現(xiàn)在檢測儀器昂貴,對實驗室條件要求高,一般無法進行快速檢測等方面。數(shù)字PCR、基因芯片技術和DNA條形碼技術仍需要進一步的研究發(fā)展以滿足監(jiān)管需求。

在未來的研究中,分子生物學檢測方法可以向快速高效低成本的方向發(fā)展,完善優(yōu)點克服缺點?，F(xiàn)階段利用這些方法進行定性檢測的研究已經(jīng)發(fā)展的比較成熟。未來應該在定量檢測方面投入更多的研究精力,區(qū)分無意沾染和有意摻假是研究的新趨勢。在物種鑒別領域,這些分子生物學方法還有許多可以發(fā)展進步的空間,科研工作者應該繼續(xù)深入研究。