施文瑞，王 磊，陳軍平，吳利敏，李學軍

( 河南師范大學 水產(chǎn)學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

魚類是目前分布最廣、種類最多的脊椎動物類群，已知的現(xiàn)存魚類約28 000余種[1]，超過了其他脊椎動物的總和，在脊椎動物的演化過程中處于承上啟下的關(guān)鍵地位。魚類具有豐富多樣的生物學特征和重要的經(jīng)濟價值，是人類獲取動物蛋白的主要途徑之一，對人類社會的生產(chǎn)生活具有重要意義。魚類的性別分化會受到外部環(huán)境因子(如溫度、光照和食物等)的影響[2]，如高溫會導致尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的遺傳雌性發(fā)育為生理雄性。魚類的生長和生殖關(guān)系密切[3]，因此了解魚類的性別決定機制對于研究其性別控制育種至關(guān)重要[4-5]，例如半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[6]、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[8]等的雌性個體比雄性個體生長快，而黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[9]和羅非魚等的雄性個體比雌性個體生長快，因此通過調(diào)控此類魚的性別比例可以快速改變其生長性狀，在養(yǎng)殖中具有重要意義。

尋找性別特異分子標記是一種較簡捷的進行雌雄鑒定的方法。性別特異分子標記是指魚類某種性別基因中特有的DNA片段，是一種通常只存在于異配性別中的特異DNA標記。近些年來，科研人員用不同的分子標記技術(shù)，如RAPD、SSR、AFLP和SNP等在一些魚類中找到了有關(guān)性別特異或性別連鎖的DNA片段，為鑒定魚類的遺傳性別，定位和鑒定魚類性染色體奠定了基礎(chǔ)。篩選魚類性別相關(guān)分子標記不僅能夠在生長發(fā)育早期鑒定魚類性別，而且可以鑒定偽雄魚和偽雌魚，這對培育具有生長優(yōu)勢性別的單性苗種以及魚類的性別控制均具有重要意義。

1 DNA分子標記技術(shù)

目前對于分子標記概念的界定有廣義和狹義兩種，廣義上的分子標記是指能夠遺傳并且檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)，狹義的分子標記(亦是本文中所提到的分子標記)則僅指DNA標記[10]。對比常規(guī)的遺傳學標記(如形態(tài)標記、細胞標記以及生化標記)，DNA分子標記具有其獨特的優(yōu)勢[11]：(1)DNA樣品的獲得不受外界環(huán)境及發(fā)育階段的影響；(2)標記數(shù)量豐富且遍布整個基因組；(3)表現(xiàn)為中性，不會影響目標性狀的表達；(4)多態(tài)性高，自然存在的等位變異多；(5)試驗所提取的DNA樣品在特定條件下能夠長期保存，對于試驗結(jié)果的驗證是非常有利的；(6)許多標記表現(xiàn)為共顯性，能夠區(qū)分純合體和雜合體。正是由于這些優(yōu)越的特性，DNA分子標記的應用十分廣泛，分子標記技術(shù)也在經(jīng)歷了數(shù)十年的發(fā)展后，日趨成熟。不同的分子標記技術(shù)具有不同的特點，魚類性別研究中常用的分子標記技術(shù)比較見表1。

表1 常用分子標記技術(shù)的比較

2 魚類性別特異性DNA分子標記研究進展

2.1 魚類性別特異RAPD標記

RAPD是由Williams等[12]于1990年利用隨機合成的單個引物進行擴增進而尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標記發(fā)展起來的一種技術(shù)，能夠快速、簡便地進行遺傳標記和遺傳多樣性分析，并廣泛應用于魚類遺傳多樣性研究以及魚類種質(zhì)鑒定等領(lǐng)域[13-15]。

楊玲等[16]以奧利亞羅非魚(O.aureus)為試驗材料，獲得了1個雌性特異性的RAPD標記片段(RAPD71699-1488)，并成功地將該RAPD標記片段轉(zhuǎn)化為SCAR標記，在兩個群體共200尾個體上(雌、雄各100尾)驗證的符合度為100%，可以應用到奧利亞羅非魚的性別遺傳鑒定中；Luzio等[17]用ISSR和RAPD技術(shù)在斑馬魚(Daniorerio)的雌雄個體中測試了100個ISSR和280個RAPD引物，將得到的3個呈現(xiàn)性別特異的DNA片段進行克隆轉(zhuǎn)化后得到序列擴增區(qū)，在斑馬魚群體中使用這些潛在標記，可以在測試群體中正確識別80%的雄性(DrSM_M)和100%的雌性(DrSM_F1tDrSM_F2)；Sun等[18]在尼羅羅非魚(O.niloticus)中利用RAPD和AFLP技術(shù)找到4個性別連鎖標記。利用RAPD技術(shù)在亞馬遜石脂鯉(Bryconamazonicus)[19]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[20]中也找到了性別特異DNA序列。

2.2 魚類性別特異AFLP標記

AFLP即擴增片段長度多態(tài)性，是1993年由Zabeau等[21]基于PCR技術(shù)發(fā)明創(chuàng)建的一種DNA分子標記技術(shù)，廣泛用于魚類遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析及標記輔助育種等[22-24]。

劉昕[25]通過AFLP技術(shù)對比分析孔雀魚(Poeciliareticulata)雌雄基因組之間的不同，得到了1個雄性特異的AFLP標記(PreF262)，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標記，建立了能夠快速鑒定孔雀魚遺傳性別的PCR技術(shù)；閆松松等[26]用AFLP技術(shù)篩選香魚(Plecoglossusaltivelis)的性別特異性分子標記，僅引物組合E-ATG/M-CTG擴增到1條雄性特異性條帶,以該雄性特異性AFLP條帶的DNA序列為模板，設(shè)計1對特異的PCR引物，并在10尾已知性別的香魚(雌雄各5尾)中擴增檢驗，結(jié)果顯示，5尾雄魚均可擴增到目的條帶，而5尾雌魚均無擴增，表明該序列是雄性特異性分子標記，可用于鑒別香魚的遺傳性別，并為香魚的性別決定機制和性別控制研究奠定基礎(chǔ)[26]；Vos等[27-28]利用AFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在太平洋藍鰭金槍魚(Thunnusorientalis)中存在雄性特征片段及其遺傳結(jié)構(gòu)的DNA序列；利用AFLP在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[29]和大顎小脂鯉(Salminusbrasiliensis)[30]中也找到了性別特異標記。

2.3 魚類性別特異SSR標記

SSR即簡單重復序列，由1～6個堿基的核心序列串聯(lián)重復而成，是一類信息量豐富、重復性好、多態(tài)性高、易操作、雜合度大的共顯性DNA分子遺傳標記，廣泛應用于魚類遺傳多樣性研究、種群親緣關(guān)系研究等領(lǐng)域[31-32]。

在半滑舌鰨中分離出性別連鎖的SSR標記CseF-SSR1，可用于區(qū)分ZW雌性和WW超雌性[33]；岳亮等[34]采用以BSA為基礎(chǔ)的微衛(wèi)星標記技術(shù)，在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)雌、雄基因池中擴增出8對差異條帶的引物，通過驗證發(fā)現(xiàn)，引物 f383是與其雄性呈正相關(guān)的微衛(wèi)星標記；Liao等[35]在半滑舌鰨中通過篩選基因組微衛(wèi)星鑒定了一個共顯性性別連鎖標記(即CyseSLM)；Xu等[36]用微衛(wèi)星標記在條石鯛(Oplegnathusfasciatus)中得到了一個Oplfa16的雄性特異性微衛(wèi)星標記。此外，在五條(Seriolaquinqueradiata)[37]、多刺魚(Pungitiuspungitius)[38]、狹鱗庸鰈(Hippoglossusstenolepis)[39]等中均可分離出性別特異微衛(wèi)星標記。

2.4 魚類性別特異SNP分子標記

SNP作為一種新興的DNA分子標記技術(shù)，具有廣闊的應用前景[40-42]。Houston等[43]用RR-seq、RNA-seq、RAD-seq技術(shù)得到了大西洋鮭(Salmosalar)>400 K的假定SNPs, 用于大西洋鮭的高密度SNP基因分型陣列, 該陣列可以清楚地區(qū)分養(yǎng)殖和野生種群內(nèi)部和之間不同來源的魚，陣列上包含的Y染色體特異性探針為性別鑒定提供準確的分子遺傳學檢測；Palaiokostas等[45]用RAD-seq構(gòu)建了尼羅羅非魚的連鎖圖譜，并發(fā)現(xiàn)了一組與性別緊密相關(guān)的SNP標記，并用RAD-seq技術(shù)構(gòu)建了第一個基于SNP的歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)連鎖圖譜，其由24個連鎖群上的6706個SNPs組成，與傳統(tǒng)的基于譜系的選擇相比，基于SNP的雌性歐洲鱸魚選擇效率顯示出輕微的優(yōu)勢，此項研究結(jié)果為歐洲鱸魚的多基因性別決定假說提供了額外的支持；王婷等[46]基于高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)SNP標記進行篩選，獲得了2個與雌、雄性狀相關(guān)的SNP標記；Bradley等[47]開發(fā)了精確的斑馬魚SNP遺傳圖譜，并將其應用于性別決定的遺傳組分研究，結(jié)果表明，斑馬魚的性別決定是一個復雜的過程，除性染色體外，還在第5號和第16號染色體上鑒定了2個在性別決定方面具有顯著統(tǒng)計學意義的基因座。Xu等[48]在巖鯛(Oplegnathusfasciatus)中利用AFLP技術(shù)開發(fā)了3種雄性特異性SNP標記，可用于該物種的遺傳性別的分子鑒定，為人工養(yǎng)殖鯛魚的進步提供支撐。

2.5 基因組測序技術(shù)在魚類性別特異標記中的研究進展

Chen等[49]對雄性(ZZ)及雌性(ZW)半滑舌鰨的整個基因組進行了測序，構(gòu)建了半滑舌鰨全基因組序列圖譜，這也是世界上第一個比目魚的基因組圖譜，從而為發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨的染色體起源、性別決定機制以及比目魚的底棲適應機制提供了珍貴的基因資源；Fowler等[50]為了鑒定性別特異性基因型標記，利用雙酶切RAD[51]技術(shù)對姊妹種肉色平鲉(Sebastescarnatus)和黃黑平鲉(S.chrysomelas)的基因組DNA進行測序，在2個群體中均能檢測到雄性特異基因座，但未檢測到雌性特異基因座，這為其由XY決定性別機制提供了證據(jù)；Chen等[41]對黃顙魚進行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)比較分析，篩選了至少21個性別決定和分化的相關(guān)基因；Wilson等[52]利用RAD標簽群體基因組學在4個斑馬魚品系中發(fā)現(xiàn)了1個單一的性別連鎖區(qū)域；Maroso等[53]使用ⅡB型限制性內(nèi)切酶的RAD[54]技術(shù)對地中海8個地區(qū)的共140尾鲯鰍(Coryphaenahippurus)進行研究，鑒定了大量SNP標記，確定了311個性別相關(guān)位點。

3 展 望

我國魚類分布廣泛，種質(zhì)資源豐富，許多魚類雌雄個體之間存在著明顯的生物學差異，如個體大小、性成熟年齡和體型等，根據(jù)雌、雄魚經(jīng)濟性狀的差異來調(diào)控其性別比例可大幅提高相關(guān)魚類的經(jīng)濟效益，因此開展這些魚類性別相關(guān)分子標記的研究具有重要意義。截至目前，雖然魚類性別相關(guān)分子標記的研究取得了一定的進展，但是仍存在一些問題。由于魚類是最低等的脊椎動物，有些性別相關(guān)分子標記在同一物種不同群體之間甚至家系之間也可能存在一些差異；另外，魚類種類較多，進化程度相差較大，有些魚類沒有進化出異質(zhì)性染色體，根據(jù)其形狀和大小很難區(qū)分其性染色體和常染色體，可利用熒光原位雜交技術(shù)對已發(fā)現(xiàn)的性別連鎖的基因或標記定位，可以鑒定性染色體，從而能夠?qū)崿F(xiàn)魚類早期的性別鑒定。高建軍等[55]發(fā)現(xiàn)能夠成功尋找到性別特異標記的魚類通常是存在性染色體的魚類，使用傳統(tǒng)方法較難篩選出性別相關(guān)分子標記。在下一代測序時代，越來越多的物種以前所未有的速度積累了序列資源，RAD-seq是在高通量測序技術(shù)的基礎(chǔ)上興起的一項基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術(shù)，具有覆蓋整個基因組的特點，可以更容易和更經(jīng)濟地開發(fā)基因組標記[51-54]及性別研究，通過RAD-seq及其衍生技術(shù)構(gòu)建遺傳圖譜，結(jié)合QTL定位闡明其性別決定機制并開發(fā)性別標記，已成為研究魚類性別及其性別特異標記的一個重要手段。近年來，隨著測序成本的下降，簡化基因組測序技術(shù)已廣泛地應用于魚類性別相關(guān)標記的篩選，相信隨著測序成本的進一步下降，基因組測序技術(shù)將全面應用于魚類性別相關(guān)標記篩選及性別調(diào)控機理研究。