李玉龍，劉修澤，吉 光，于旭光，李軼平，付 杰，王小林，郭 棟，董 婧

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

鲬屬(Platycephalus)魚類廣泛分布于印度—西太平洋海域，是一類具有較高經(jīng)濟價值的大型底棲性經(jīng)濟魚類，屬鲉形目、鲬科[1-3]。目前鲬屬具有有效種名的種類為16種，絕大多數(shù)分布于東南亞和大洋洲海域，西北太平洋海域僅分布有兩種，分別為印度鲬(Platycephalusindicus)和刀鲬(P.cultellatus)[1-4]。但近期的研究表明，在鲬屬魚類中尚存在很多隱蔽種，有關(guān)其分類以及一些物種的有效性方面也存在諸多爭議[4-6]。在目前的形態(tài)分類研究中，黃、渤海分布的鲬種類一直被定為印度鲬，且被認定是我國沿海分布的唯一鲬屬魚類[1-4]。秦巖等[4-5]通過對采自東營、青島、舟山及北海近海共174尾鲬的形態(tài)特征和DNA條形碼分析后認為，廣泛分布于我國沿海的鲬并非印度鲬，而與東北亞海域發(fā)現(xiàn)的一個種名未定的鲬屬有效種Platycephalussp.1更為接近，將其稱為褐斑鲬并作為一個新種加以描述。

近年漁業(yè)資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在黃渤海經(jīng)濟魚種資源衰退的背景下，鲬已成為遼寧沿海為數(shù)不多的尚有一定產(chǎn)量的經(jīng)濟種類，但其年資源量浮動較大，且缺乏對其種群狀況及遺傳背景的詳細了解。目前對鲬屬魚類進行的分子遺傳方面的研究相對較少，僅見利用線粒體COⅠ基因序列和控制區(qū)部分序列進行鲬屬魚類的DNA條形碼分析和群體遺傳分析[4-6]，對鲬屬魚類線粒體控制區(qū)全序列多態(tài)性及結(jié)構(gòu)功能方面的研究鮮見報道。對魚類線粒體控制區(qū)D-loop序列、結(jié)構(gòu)功能進行研究，不僅有助于探明線粒體DNA復制、轉(zhuǎn)錄啟動機制和進化規(guī)律，對進一步了解相關(guān)種類的分類鑒定、遺傳多樣性及種質(zhì)資源狀況也具有重要意義。因此，本研究測定了渤海遼東灣和黃海北部鲬群體的線粒體控制區(qū)全序列，并與已知的其他鲬屬魚類同源序列進行比較和分析，明確分布于遼寧沿海鲬的分類地位，為今后進一步檢測其遺傳多樣性狀況以及進行該物種的監(jiān)測和資源保護提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與種類鑒定

2014—2015年，在遼寧沿海漁業(yè)資源調(diào)查時獲得鲬樣品25尾，其中遼東灣海域20尾，黃海北部海域5尾。參照《海洋生物名錄》[1]、《黃渤海魚類圖志》[2]和《遼寧省動物志·魚類》[3]等資料進行種類鑒定。此外，參照文獻[4-5]列出的鲬屬魚類的形態(tài)特征差別，根據(jù)側(cè)線鱗數(shù)和尾鰭顏色對25尾遼寧沿海鲬樣品進行形態(tài)分類鑒定，發(fā)現(xiàn)遼寧沿海鲬應為褐斑鲬，而非以往一直認為的印度鲬(表1)，據(jù)此將采集的遼寧沿海鲬統(tǒng)一視為褐斑鲬加以描述，并通過本研究的結(jié)果進行驗證。遼寧沿海鲬經(jīng)形態(tài)鑒定后于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 遼寧沿海鲬樣品與4種鲬屬魚類形態(tài)特征比較

1.2 DNA提取、擴增和測序

采用CTAB法提取基因組DNA后，參考GenBank中已報道的印度鲬線粒體全序列(登錄號AP006783)，選擇位于控制區(qū)兩側(cè)保守性較高的區(qū)域設(shè)計合成擴增引物，DL-F: 5′-CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3′，DL-R: 5′-TTAACTCCCACCCCTGGCT-3′，對樣品進行擴增，PCR反應體系25 μL，包括0.2 mmol/L每種dNTPs，0.2 μmol/L每種引物，1 μL DNA模板，1 U Taq，2.0 mmol/L MgCl2，2.5 μL 10×緩沖液，滅菌超純水補足剩余體系。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序，測序引物與擴增引物一致。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Bioedit軟件[7]對測序所得序列進行拼接并輔以人工校對，通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)檢索確定為目的片段。應用CLUSTAL X 1.83軟件對序列進行比對分析。根據(jù)印度鲬線粒體基因組全序列確定控制區(qū)的起點和終點，并參照已報道的魚類線粒體控制區(qū)結(jié)構(gòu)特征，對遼寧沿海鲬線粒體控制區(qū)全序列進行結(jié)構(gòu)特征分析。Mega 5.0軟件[8]統(tǒng)計堿基含量、變異位點, 采用Kimura雙參數(shù)模型計算單倍型間遺傳距離。單倍型數(shù)、多態(tài)位點數(shù)、單倍型多態(tài)度、核苷酸多態(tài)度等分子多樣性指數(shù)以及中性檢驗和核苷酸不配對分布等群體歷史動態(tài)分析由Arlequin3.5[9]軟件計算，擴張參數(shù)τ通過公式τ=2ut轉(zhuǎn)化為實際的擴張時間，其中u是所研究的整個序列長度的突變速率。鲬屬魚類缺乏線粒體控制區(qū)分子鐘的相關(guān)資料以及化石證據(jù)，本研究采用3%/百萬年～10%/百萬年這一海洋魚類線粒體控制區(qū)序列突變速率假設(shè)[10]對遼寧沿海鲬群體的擴張時間進行估算。采用中介網(wǎng)絡法[11]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧沿海鲬控制區(qū)序列變異及遺傳多樣性分析

基于控制區(qū)全序列的鲬屬種內(nèi)和種間的遺傳距離見表2?；贒-loop計算的遼寧沿海鲬樣品與文獻[4]描述的褐斑鲬(登錄號KC662184)間的遺傳距離為0.005，其種內(nèi)的遺傳距離為0～0.008，平均遺傳距離為0.003，這一結(jié)果也從基因?qū)用嫔线M一步證實，25尾遼寧沿海鲬樣品為文獻[4-5]中描述的褐斑鲬。褐斑鲬與印度鲬間的差異較大(0.093～0.153)，而印度鲬日本樣品(登錄號AP006783)與中國樣品(登錄號KC662185)間的遺傳距離為0.151，遠高于種內(nèi)水平，甚至高于不同種間的遺傳距離，提示兩者為不同的種。

遼寧沿海25尾褐斑鲬控制區(qū)全序列中共檢測到22個變異位點，約占總序列長度的2.5%，其中包括20個轉(zhuǎn)換、顛換位點和2個插入/缺失位點(表3)。經(jīng)Mega 5.0軟件計算得到序列中A、T、G和C平均堿基含量分別為30.7%、31.1%、16.2%和22.0%，與其他魚類控制區(qū)堿基組成相似，控制區(qū)全序列A+T含量(61.8%)明顯高于C+G含量(38.2%)。不計位于保守序列區(qū)的2個插入/缺失位點，20個變異位點中檢測到11個變異位點位于終止序列區(qū)內(nèi)(55%)，6個變異位點位于中央保守區(qū)，3個變異位點位于保守序列區(qū)。25尾個體中共得到16個單倍型，其中3個為共享單倍型, 其他為特有單倍型。遼寧沿海褐斑鲬群體核苷酸多樣性指數(shù)相對較低(0.0026±0.0017)，而單倍型多樣性指數(shù)相對較高(0.92±0.04)。

表2 基于D-loop序列的鲬屬種內(nèi)和種間遺傳距離

表3 遼寧沿海褐斑鲬不同單倍型控制區(qū)序列的變異位點分布

遼寧沿海褐斑鲬控制區(qū)全序列單倍型間中介網(wǎng)絡關(guān)系見圖1，網(wǎng)絡關(guān)系呈現(xiàn)明顯的星狀結(jié)構(gòu)，主體單倍型Hap7位于網(wǎng)絡中心，其他所有單倍型通過一步或多步突變與該主體單倍型相連，對遼寧沿海褐斑鲬群體進行Tajima′sD檢驗[12]和Fu′sFs檢驗[13]的結(jié)果也均為負值且檢驗均顯著(P<0.05)，提示褐斑鲬在遼寧沿?？赡芙?jīng)歷了近期的群體擴張。此外，用核苷酸不配對分布分析了褐斑鲬遼寧沿海群體的歷史動態(tài)。遼寧沿海褐斑鲬群體核苷酸不配對分布呈單峰類型(圖2)，對θ0和θ1進行的估算表明，褐斑鲬群體經(jīng)歷過明顯的群體增長，也提示分布于遼寧沿海的褐斑鲬群體經(jīng)歷過近期的群體擴張事件。遼寧沿海褐斑鲬的τ值的觀測值為1.656(95%置信區(qū)間:1.063～3.338)，根據(jù)控制區(qū)序列3%/百萬年～10%/百萬年的進化速率u和τ值用公式τ=2ut推算出的遼寧沿海褐斑鲬群體擴張時間t約為19 000～63 000 年。

2.2 鲬屬魚類控制區(qū)序列特征

參照印度鲬線粒體基因組全序列，確定遼寧沿海褐斑鲬控制區(qū)的起點和終點，其線粒體控制區(qū)全長為876～878 bp。對比已報道的鯉形目、鲇形目、鰈形目、鱸形目、鯡形目及鲉形目等魚類線粒體控制區(qū)結(jié)構(gòu)[14-28]，將CSB-F和CSB-1分別作為識別終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)的界線，識別了鲬屬魚類終止序列區(qū)的TAS序列、中央保守區(qū)的CSB-F、CSB-E和CSB-D的核心序列以及保守序列區(qū)的CSB1、CSB2和CSB3的核心序列。

圖1 褐斑鲬單倍型網(wǎng)絡關(guān)系

圖2 遼寧沿海褐斑鲬D-loop序列核苷酸不配對分布圖

終止序列區(qū)通常也被稱為高變區(qū)，該區(qū)域是控制區(qū)內(nèi)變異速率最快的區(qū)域。褐斑鲬控制區(qū)終止序列區(qū)長度為308 bp，印度鲬為306～309 bp，在鲬屬魚類檢測到1個與終止相關(guān)的序列——ETAS，其普遍形式為TACATATATGTA，ETAS序列主體的核心部分是TACAT及其反向互補序列ATGTA(圖3)，可形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這與鲀科魚類[14]及同目的松江鱸(Trachidermusfasciatus)[15-16]的TAS序列極為相似。此外，在鲬屬魚類中還檢測到另外1個可能的TAS序列，褐斑鲬為TACATATATGTA，印度鲬則為CACATATATGTT，兩者略有不同，在鲬屬魚類中未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復序列。

作為控制區(qū)中最為保守的區(qū)域，本研究在鲬屬魚類中央保守區(qū)識別出CSB-D、CSB-E、CSB-F 3個特征片段，全長363 bp。其中CSB-F序列為ATGCAGTAAGAACCGACCAA，緊接其后的CSB-E序列為AGGGACAATTATTGTGGGGG，含有Lee等[17]所描述的GTGGG-box，CSB-D序列為TATTCCTGGCATTTGGTTCCT。鲬屬魚類中央保守區(qū)D、E、F 3個保守片段的特征序列與近年來報道的其他魚類差異不大，較為保守，容易識別。

鲬屬魚類保守序列區(qū)全長205～207 bp，通常包含3個保守序列CSB1、CSB2和CSB3。通過比較發(fā)現(xiàn)，CSB1變異最大，不易識別，與已報道的一些魚類CSB1 3′端均含有特征基序GACATA不同，鲬屬魚類中未發(fā)現(xiàn)此特征基序，其CSB1普遍形式為ATAACTGATATCATGTACATAA……ATTACCCCC，核心序列為ATAACTGATATCATGTACATAA，與暗紋東方鲀(Takifugufasciatus) CSB1序列(ATTATTGATATCAAGGACATAA)[12]較為相似，僅有4個堿基的差異；其后有1個較為保守的TATGCCCCC序列，這與松江鱸(TGATTTATTACTCGAAACT……ATTTACCCCCC)[13-14]、鳑鲏魚類(TTATTATTGAAGACATA ……TATGCCCCC序列)[18]CSB1后邊檢測到的一個以5～6個串聯(lián)C形式存在的保守序列類似。CSB2含有以TA間隔的兩段串聯(lián)的C，其序列為AAACCCCCCTACCCCCCTAA，CSB2的普遍形式TGAAAACCCCCCGGAAACAG，含有魚類中以3～6個以串聯(lián)形式存在的A和C的典型特征(圖3)。鲬屬魚類的CSB2、CSB3序列相對較為保守，易于識別。

圖3 鲬屬魚類線粒體控制區(qū)序列及結(jié)構(gòu)終止相關(guān)序列(ETAS)、中央保守序列(CSB-F, CSB-E, CSB-D)和保守序列(CSB1, CSB2, CSB3)用陰影表示; 關(guān)鍵序列用方框表示.

3 討 論

3.1 遼寧沿海鲬樣品種類鑒定

形態(tài)學特征分析和mtDNA控制區(qū)條形碼分析的結(jié)果均顯示，本次獲得的遼寧沿海鲬實為褐斑鲬，而非以往一直認為的印度鲬。遼寧沿海25尾鲬樣品背鰭鰭條13～14，臀鰭鰭條13～14，胸鰭鰭條17～19，腹鰭鰭棘Ⅰ，腹鰭鰭條5，側(cè)線鱗數(shù)目85～94，尾鰭無黃色條紋，這些特征符合秦巖等[4-5]對褐斑鲬形態(tài)特征的描述。DNA條形碼一直被認為是鑒別種類的高效而可靠的方法，本研究中，基于D-loop計算的遼寧沿海25尾鲬樣品的遺傳距離為0～0.008，與褐斑鲬(登錄號KC662184)樣品間的遺傳距離為0.005，屬于種內(nèi)差異水平，遠小于鲬屬魚類之間種間進化距離(表2)，也證實遼寧沿海鲬樣品為褐斑鲬而不是印度鲬。此外，中國海域印度鲬樣品與日本附近海域印度鲬樣品間差異極大，甚至大于屬內(nèi)不同種間的遺傳距離，表明兩者為不同的種，這佐證了其他研究者報道的鲬屬魚類中存在隱蔽種的觀點，另一種可能是樣品鑒定有誤，導致結(jié)果出現(xiàn)偏差。

3.2 遼寧沿海褐斑鲬控制區(qū)序列變異及群體遺傳多樣性分析

由于受選擇壓力小、進化速度快，線粒體DNA控制區(qū)是進行魚類遺傳多樣性研究應用最廣泛的分子標記。本研究利用線粒體控制區(qū)全序列對遼寧沿海褐斑鲬群體進行的遺傳多樣性分析表明，其核苷酸多樣性指數(shù)(0.0026±0.0017)相對較低，而單倍型多樣性指數(shù)(0.92±0.04)相對較高，屬于海水魚類中高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性的遺傳多樣性模式[29]，這種遺傳多樣性模式在遼寧沿海分布的海洋生物中普遍存在，如彎棘斜棘(Repomucenuscurvicornis)[30]、細紋獅子魚(Liparistanakae)[31]、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[32]及海蜇(Rhopilemaesculentum)[33-34]等。究其原因，通常認為由于這些海洋生物種群經(jīng)歷了近期的群體擴張，群體的快速增長積累了豐富的單倍型多樣性，但缺乏足夠的時間來積累足夠的核苷酸變異導致[29-33]。在遼寧沿海褐斑鲬群體中檢測到的星狀結(jié)構(gòu)的單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖、單峰類型的核苷酸不配對分布，以及檢驗顯著的負的Fu′sFs值和Tajima′sD值均揭示，褐斑鲬經(jīng)歷了近期的群體增長。根據(jù)參數(shù)τ推算，遼寧沿海褐斑鲬群體擴張時間距今約19 000～63 000年，這一時間刻度與晚更新世末—全新世初黃渤海海域發(fā)生的多次大范圍的海侵和洋面回升事件相吻合，在這一時期，與褐斑鲬同域分布的其他幾種海水魚類如梭魚(Lizahaematocheila)[10]、彎棘斜棘[30]、黃姑魚(Nibeaalbiflora)[35]、棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)[36]等也經(jīng)歷了類似的晚更新世群體擴張事件。

3.3 鲬屬魚類線粒體控制區(qū)的結(jié)構(gòu)

控制區(qū)與線粒體DNA的復制、終止、轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，是線粒體DNA中進化最快、結(jié)構(gòu)最復雜的區(qū)域。在對多種魚類線粒體控制區(qū)結(jié)構(gòu)進行的研究表明，魚類控制區(qū)的基本結(jié)構(gòu)大致相同，主要的功能單元較為保守，易于識別，例如終止序列區(qū)(ETAS)的終止相關(guān)序列以及中央保守區(qū)序列(CSB-F、CSB-E、CSB-D)和保守區(qū)序列(CSB1、CSB2、CSB3)等[14-28]。此外在一些魚類如鯡形目[22]、鰈形目[27]種類中檢測到控制區(qū)全序列存在長度多態(tài)性現(xiàn)象，終止序列區(qū)長串聯(lián)重復序列的存在是造成其長度不同的主要原因。本研究通過與其他魚類的比對，識別了鲬屬魚類終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)的相關(guān)核心序列。在終止序列區(qū)中識別了可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的特征序列(ETAS)，其主體序列為TACAT及反向互補序列ATGTA。在鲬屬魚類中未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復序列，但檢測到另外一個可能發(fā)生變異的終止相關(guān)序列，褐斑鲬為TACATATATGTA，印度鲬則為CACATATATGTT，推測可能僅第一個ETAS能夠行使功能，這也佐證了劉煥章[18]的研究結(jié)論，他認為魚類只有一個行使功能的ETAS，但可能存在多個復制的不行使功能的ETAS。

中央保守區(qū)的CSB-F、CSB-E、CSB-D的特征序列均相對比較保守，CSB-E 的關(guān)鍵序列中含有GTGGG-box序列[10]，與其他多種魚類的研究結(jié)果[14-15,17-18,22]相似。保守序列區(qū)的CSB1特征序列在魚類中存在著較大變異，不易被識別[17-18,22]。在鲬屬魚類保守序列區(qū)內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)CSB1的特征序列(GACATA)，參照暗紋東方鲀[14]及其他魚類的CSB1序列，本研究發(fā)現(xiàn)，鲬屬魚類的CSB1序列為ATAACTGATATCATGTACATAA，并在其后檢測到1個較為保守的TATGCCCCC序列，這與松江鱸[15-16]、鳑鲏魚類[18]等類似。鲬屬魚類的CSB2和CSB3序列相對保守，其中CSB2最為保守，含有以1～3個嘧啶核苷酸間隔的兩段串聯(lián)的C；CSB3富含A和C，與目前已知的魚類線粒體控制區(qū)的結(jié)構(gòu)和進化規(guī)律一致[14-28]。

綜上所述，分布于遼寧沿海的鲬為褐斑鲬，而非以往認定的印度鲬；遼寧沿海褐斑鲬群體遺傳多樣性水平偏低，這可能與其自然資源的破壞及過度捕撈有關(guān)。由于受采樣范圍及數(shù)量限制，對褐斑鲬遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)方面的了解仍較為缺乏，但本研究的結(jié)果表明，線粒體控制區(qū)序列是進行鲬屬魚類群體遺傳學研究的良好分子標記，可為下一步褐斑鲬的種質(zhì)資源保護、可持續(xù)利用及漁業(yè)資源管理提供基礎(chǔ)資料。