黃 凱，林亞秋，朱江江，馬潔瓊，王 永*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041)

成纖維細(xì)胞生長因子家族(Fibroblast Growth Factors，F(xiàn)GFs)總共有 23 個成員［1－3］，是一類由垂體和下丘腦分泌的具有多種生物學(xué)功能的信號蛋白。家族各成員之間有20%～50%相同的氨基酸序列，其中心區(qū)域更有約120個氨基酸序列存在高度的同源性［4］。FGFs被證明在各種生理過程中發(fā)揮著重要作用，如胚胎發(fā)生、腫瘤形成、組織修復(fù)以及細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡等［5－6］，成纖維細(xì)胞生長因子1(FGF1)是成纖維細(xì)胞生長因子家族中的一員，關(guān)于FGF1的作用研究最初主要集中在腫瘤發(fā)生等方面，關(guān)于其在脂代謝、糖尿病等方面的作用直到近幾年才引起重視。Hutley等研究表明，外源性FGF1可促進(jìn)人前體脂肪細(xì)胞的增殖與分化;2011年，又研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF1能夠通過抑制FGF2的表達(dá)促進(jìn)人的前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞方向分化［7－8］。2012年，Jonker等發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)敲除FGF1的小鼠中能出現(xiàn)脂肪的異常增生［9］。上述研究均表明FGF1在脂代謝和脂肪細(xì)胞分化中具有重要作用，但研究主要集中于人和小鼠，在山羊中還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)其在山羊前體脂肪細(xì)胞分化前后表達(dá)水平發(fā)生變化，推測其對山羊前體脂肪細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)控作用。

超表達(dá)和干擾是分子生物學(xué)中研究基因功能的重要手段，因此本實(shí)驗(yàn)室為了最終闡明FGF1基因?qū)ι窖蚯绑w脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用，需要利用上述兩種手段，而目的基因超表達(dá)載體的構(gòu)建是超表達(dá)研究所必須的步驟。因此本研究擬利用pAdEasy系統(tǒng)構(gòu)建山羊FGF1超表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及樣品采集

本試驗(yàn)所用細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室前期分離、鑒定和培養(yǎng)獲得［10］。

1.2 主要試劑

pGM-T連接試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞 DH5α、D2000 DNA Marker、D15000 DNA Marker、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)均購自北京天根生化科技有限公司;SYBRPremix Ex Taq TM(2×)購自Takara公司;限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ與限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、Hind III均購自Thermo公司;卡那霉素購自biosharp公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、DME/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶與雙抗均購自Hyclone公司;胎牛血清購自Gemini公司;LipofectamineTM3000與購自Invitrogen公司;HEK 293細(xì)胞系由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈予;含有腺病毒骨架pAdEasy-1的E.coli BJ5183菌種與穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV由西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈予。

1.3 目的基因的亞克隆

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得的山羊FGF1基因(GenBank登錄號KT899959)序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對帶有酶切位點(diǎn)的引物，上下游分別帶有KpnⅠ和Hind III的酶切位點(diǎn)，引物序列見表1。送交生物公司進(jìn)行合成。

1.3.2 完整CDS區(qū)的克隆 以背部皮下脂肪組織提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模板，與表1中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:模板cDNA 1.0(l，2 × Long Taq PCR Master Mix 12.5 μl，10 μmol·L－1、下游引物各 1.0(l，ddH2O 9.5 μl。反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性4 min;94℃ 20 s，Tm 60 s，72℃ 90 s;39個循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢查，確認(rèn)片段大小與預(yù)期相符，參照DNA凝膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行純化回收。

1.3.3 質(zhì)粒 pGM-T-FGF1的獲得 將 FGF1基因回收片段與pGM-T載體進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物pGM-T-FGF1，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，取經(jīng)菌落PCR鑒定正確的菌液搖床培養(yǎng)，擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，用KpnⅠ和Hind III對獲得的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.4 質(zhì)粒pAdTrack-CMV的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與提取

穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV采用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，過夜培養(yǎng)后挑取陽性菌落并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)提取質(zhì)粒pAdTrack-CMV。

1.5 腺病毒穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-FGF1的構(gòu)建與鑒定

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGM-T-FGF1和穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind III同時進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，1%凝膠電泳檢測后，分別純化回收FGF1片段和穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV大片段。將FGF1片段與線性化的質(zhì)粒大片段用T4 DNA連接酶連接，16℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，接種于含卡那霉素的瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(37℃，180 r/min，14 h)并提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-FGF1并送生物公司測序。

1.6 重組腺病毒 pAdEasy-FGF1的構(gòu)建與鑒定

用PmeI酶切線性化陽性的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-FGF1，然后轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含kan的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)(37℃，180 r/min，14 h)提取質(zhì)粒，進(jìn)行PacI酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pAdEasy-FGF1并送生物公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.7 重組腺病毒pAdEasy-FGF1的包裝與擴(kuò)增

陽性質(zhì)粒pAdEasy-FGF1進(jìn)行PacI酶切，并利用異丙醇沉淀法純化回收酶切后的DNA。將293A細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行復(fù)蘇，待其長至80%融合時，取8 μg純化回收后的DNA按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000說明轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。此后每天換液，并觀察293A細(xì)胞綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的表達(dá)情況與病變情況。轉(zhuǎn)染后7～8 d，觀察出現(xiàn)彗星尾巴樣熒光，再等1～2 d收毒。收集的細(xì)胞毒液經(jīng)37℃ 30 min，－80℃ 30 min反復(fù)3次使細(xì)胞破裂釋放出病毒。收集的第1代病毒再用于感染293A細(xì)胞，通過3～4代感染擴(kuò)增病毒。

1.8 重組腺病毒pAdEasy-FGF1侵染山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞

培養(yǎng)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞F3代長至80%融合時，加入包裝后的重組腺病毒pAdEasy-FGF1毒液，感染48 h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA，參照試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時熒光定量PCR檢測FGF1的表達(dá)情況。qPCR反應(yīng)體系如下:SYBRPremix Ex Taq TM(2 × )PCR 10 μl，10 μmol·L－1上下游引物各 1 μl，模板 cDNA 1 μl，ddH2O 7 μl。反應(yīng)條件:95 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃ 10 s，Tm 10 s，72 ℃ 15 s，40 個循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 21.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用t檢驗(yàn)對不同組別的差異進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-FGF1的構(gòu)建與鑒定

圖1 pAdTrack-CMV-FGF1雙酶切鑒定Fig.1 Digestion identification of pAdTrack-CMV-FGF1

圖2 pAdEasy-FGF1的Pac I酶切鑒定Fig.2 Digestion identification of pAdEasy-FGF1

取重組的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-FGF1進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8%凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示，得到1條約500 bp的目的基因片段和1條約9.2 kb的pAdTrack載體片段(圖1)?；厥招∑螠y序后與FGF1基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示回收片段與FGF1基因CDS區(qū)序列完全吻合，證明穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-FGF1構(gòu)建成功。

2.2 重組腺病毒 pAdEasy-FGF1的構(gòu)建與鑒定

重組腺病毒載體pAdEasy-FGF1經(jīng)PacI酶切后電泳，獲得1條30 kp的帶和1條4.5 kp的帶(圖2)，測序結(jié)果顯示插入片段與預(yù)期序列一致，表明成功構(gòu)建腺病毒超表達(dá)載體pAdEasy-FGF1。

2.3 重組腺病毒pAdEasy-FGF1的包裝與擴(kuò)繁

pAdEasy-FGF1經(jīng)Pac I酶切線性化之后轉(zhuǎn)染培養(yǎng)復(fù)蘇的293A細(xì)胞(圖3)，轉(zhuǎn)染72 h后倒置熒光顯微鏡下可觀察到GFP的表達(dá)，轉(zhuǎn)染7 d后出現(xiàn)病毒包裝過程中典型的“彗星尾”現(xiàn)象(圖4-A)，8 d后大部分細(xì)胞出現(xiàn)熒光。收集細(xì)胞毒液，反復(fù)感染293A細(xì)胞3代后(圖4-B)可獲得高滴度的腺病毒。

2.4 pAdEasy-FGF1感染山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞后對FGF1表達(dá)的影響

圖3 正常的293A細(xì)胞(200×)Fig.3 Normal 293Acelsl(200 × )

圖4 pAdEasy-FGF1轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后GFP表達(dá)情況(100×)Fig.4 GFP expression of 293A cell transfected by pAdEasy-FGF1

重組腺病毒pAdEasy-FGF1經(jīng)包裝后感染山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，2 d后，約有60%的細(xì)胞被腺病毒感染并產(chǎn)生熒光。收集細(xì)胞，提取RNA，實(shí)時熒光定量PCR檢測FGF1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與未感染病毒的前體脂肪細(xì)胞空白組相比，F(xiàn)GF1 mRNA的表達(dá)水平增加了約350倍，被成功超表達(dá)(圖5)。說明表達(dá)FGF1的重組腺病毒載體構(gòu)建成功，并在293A細(xì)胞中成功包裝，具有在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)FGF1的能力。

3 討論

目前被廣泛應(yīng)用的病毒載體有腺病毒(Adenoviruses)、慢病毒(Lentivirus)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)載體等。與只能感染分裂期細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒和具有一定致病性的慢病毒相比，腺病毒載體能夠感染處于分裂期和非分裂期的細(xì)胞，并且感染譜廣、容量大、體外可操作性強(qiáng)，因此是目前基因轉(zhuǎn)移運(yùn)用最廣泛的載體之一［11］。基礎(chǔ)研究常用的腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)pAdEasy是由He等(1998)于1998年提出來的，該系統(tǒng)首先將目的基因插入到穿梭載體(pAdTrack-CMV)中，然后用PmeI酶切使之線性化，線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到含有骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中。穿梭質(zhì)粒與骨架載體的重組方式有2種，也正因?yàn)橹亟M方式的不同，重組腺病毒質(zhì)粒PacⅠ酶切鑒定也顯示2種不同的結(jié)果，因此其條帶出現(xiàn)在4.5 kb處或是3.0 kb處都可認(rèn)為其重組成功［12］。

圖5 轉(zhuǎn)染pAdEasy-FGF1質(zhì)粒對山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞FGF1基因表達(dá)的影響Fig.5 Expression of FGF1 gene after goat’s preadipocyte infected by pAdEasy-FGF1

本試驗(yàn)通過酶切已知載體得到了外源目的基因，成功構(gòu)建了穿梭載體 pAdTrack-CMV-FGF1，通過同源重組，將外源目的基因FGF1整合到腺病毒骨架載體中，得到了pAdEasy-FGF1，由于各種正常組織均能表達(dá)腺病毒特異性受體柯薩奇/腺病毒受體(coxsackie/adenovirus receptor，CAR)［13］，因此本研究所構(gòu)建的腺病毒超表達(dá)載體能用于感染各種類型的細(xì)胞，適用于下一步對山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞進(jìn)行超表達(dá)的研究。但是，腺病毒載體的目的基因不能整合到靶細(xì)胞基因組上，容易造成目的基因丟失、不能長期表達(dá)［14］。因此，病毒擴(kuò)繁不宜超過五代，在試驗(yàn)中最好采用第3代或第4代病毒進(jìn)行研究，以獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果［15］。包裝擴(kuò)繁后的pAdEasy-FGF1感染山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞;實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，pAdEasy-FGF1可以極顯著上調(diào)FGF1 mRNA的表達(dá)水平，為后續(xù)研究FGF1對山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

腺病毒超表達(dá)載體pAdEasy-FGF1通過同源重組構(gòu)建成功，于293A細(xì)胞中成功包裝。包裝的pAdEasy-FGF1感染山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞后，檢測其FGF1 mRNA的表達(dá)水平與未感染病毒的前體脂肪細(xì)胞空白組相比增加了約350倍，被成功超表達(dá)。