許惠艷，張?bào)丬荆瑮钚′?，盧晟盛，梁興偉，陸陽清，張 明，盧克煥

(1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530005;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

【研究意義】水牛是亞熱帶地區(qū)的特殊物種，提供重要的奶、肉供應(yīng)，是畜牧產(chǎn)業(yè)中重要的家畜之一，但繁殖能力較低。借助胚胎生物技術(shù)可提高水牛繁殖能力，可進(jìn)一步滿足人們生活的需求［1］。在胚胎體外生產(chǎn)中，卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量是影響后續(xù)研究效率的關(guān)鍵因素之一［2］，卵子和植入前胚胎中脂肪成分對哺乳動(dòng)物發(fā)育非常重要，可影響卵子成熟及胚胎附植［3］。研究影響卵母細(xì)胞體外成熟的脂肪因素，可進(jìn)一步了解卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)機(jī)制［4］，為后續(xù)研究提供一定的理論參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】卵子質(zhì)量是影響雌性生殖效率的關(guān)鍵因素之一［5］，在體外培養(yǎng)液中添加碳水化合物可對卵子成熟及胚胎發(fā)育起到關(guān)鍵的作用。Prates等［6］的研究表明脂肪酸β-氧化是卵子成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育重要能量來源之一，添加脂類成分相關(guān)物質(zhì)可提高卵母細(xì)胞體外成熟。Ferguson等［7］對牛卵子成熟過程的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪滴的形狀、體積和位置會(huì)隨著脂肪分解活性而發(fā)生改變。Jin等［8］對豬卵母細(xì)胞成熟過程的研究表明，細(xì)胞內(nèi)的脂肪與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)及細(xì)胞質(zhì)成熟過程相關(guān)。卵子成熟過程中，細(xì)胞內(nèi)的脂肪除了位置、形成、體積等改變外，細(xì)胞內(nèi)脂肪的含量和分布模式也相應(yīng)發(fā)生變化。Auclair等［9］對牛成熟卵子體外成熟過程的研究表明，體外成熟后的MII卵子脂肪含量顯著低于GV期卵母細(xì)胞中脂肪含量，說明卵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪可能作為卵母細(xì)胞成熟、后續(xù)受精及胚胎發(fā)育的重要能量物質(zhì)。Ambruosi等［10］對馬卵母細(xì)胞成熟過程的研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪分布隨成熟階段的變化也呈現(xiàn)不同的分布模式，這種現(xiàn)象可能與卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大型家畜成熟前后卵母細(xì)胞中脂肪含量及脂肪分布模式已有相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于亞熱帶地區(qū)特有家畜水牛成熟前后卵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量變化及脂肪分布模式的研究還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】進(jìn)行水牛GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期成熟卵母細(xì)胞中的脂肪含量及分布模式的研究，為水牛卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)機(jī)理的深入探討、水牛卵母細(xì)胞體外成熟體系的優(yōu)化及卵子體外成熟效率的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液為TCM-199+26.2 mM NaHCO3+5 mM Hepes+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+100 μM 半胱氨酸(cysteamine)+0.5 μg/mL 促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)+5 μg/mL 促黃體素(luteinizing hormone，LH)+3%黃牛卵泡液(bovine follicular fluid，BFF)，洗卵液為 TCM-199+20 mM Hepes+5 mM NaHCO3+4%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)+0.003 g/mL 青霉素 +0.005 g/mL鏈霉素。TCM-199粉劑購自Gibco生物化學(xué)公司，其余藥品均購自Sigma生物化學(xué)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 未成熟卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體的采集 卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的收集、成熟及培養(yǎng)參照 Lu等［11］的方法進(jìn)行。供試驗(yàn)的水牛卵巢從當(dāng)?shù)赝涝讏鋈〉?，放?7℃的生理鹽水中，并于3～4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。選擇卵巢中直徑大小為2～8 mm的卵泡，用帶有12號(hào)針頭的10 mL進(jìn)行未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的采集。

1.2.2 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 (1)未成熟卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備。在體視顯微鏡下，選擇胞質(zhì)均勻、包被完整的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用洗卵液洗3遍去除雜質(zhì)后，一部分COCs放入含有0.1%透明質(zhì)酸酶的洗卵液中，用200 μl的移液槍反復(fù)吹打去除卵丘細(xì)胞，然后在體視顯微鏡下，挑出卵丘細(xì)胞脫落完全、胞質(zhì)均勻的GV期未成熟卵母細(xì)胞待用。

(2)成熟卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備。在體視顯微鏡下，一部分未成熟的COCs，用洗卵液洗3遍去除雜質(zhì)后，再用預(yù)先平衡好的成熟液洗2遍后，放入38.5℃、5%CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h后，用200 μl的移液槍反復(fù)吹打去除卵丘細(xì)胞，然后在體視顯微鏡下，挑出卵丘細(xì)胞脫落完全、胞質(zhì)均勻、排出第一極體的MII期成熟卵母細(xì)胞待用。

1.3 卵母細(xì)胞內(nèi)脂肪含量及分布模式的測定

1.3.1 卵子內(nèi)脂肪分布模式的特征 外圍分布(Peripheral)表示脂肪滴分布在卵母細(xì)胞的周圍區(qū)域，半均勻分布(Semi-peripheral)表示脂肪滴在卵母細(xì)胞中心分布有少量的分布，多分布在皮質(zhì)的外圍，均勻分布(Diffuse)表示脂肪滴均勻分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(圖 1，bar=50 μm)。

1.3.2 卵母細(xì)胞中脂肪濃度及脂肪分布模式的測定 水牛卵子內(nèi)脂肪含量的測定參考Paczkowski等的方法［12］進(jìn)行。將GV期未成熟的卵母細(xì)胞和MII期成熟的卵母細(xì)胞分別放入4%的甲醛固定液中固定30 min，然后把待檢測的卵子放入到含有10 μg/mL Nile red的洗卵液中，室溫黑暗環(huán)境中染色4～5 h后，用PBS洗滌多余的染料，最后把卵子放入都載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。所得圖像用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度，依據(jù)熒光強(qiáng)度來計(jì)算卵母細(xì)胞中總脂肪含量。根據(jù)拍照的圖像中脂肪在卵母細(xì)胞中的分布情況，記錄脂肪的分布模式，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism5的單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行脂肪含量及脂肪分布模式的統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 水牛卵母細(xì)胞中脂肪分布模式Fig.1 Lipid distribution pattern in buffalo oocytes

2 結(jié)果與分析

2.1 GV期未成熟卵母細(xì)胞及MII期成熟卵母細(xì)胞中脂肪含量的比較

由圖2可知，MII期卵子中脂肪含量顯著低于GV 期脂肪含量(66.63 ±1.197 vs.70.81 ±1.328;GV:n=50，MII:n=49;P ＜0.05)，可見水牛卵母細(xì)胞在成熟過程中，卵子內(nèi)脂肪含量呈下降趨勢。

2.2 GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期卵母細(xì)胞中脂肪分布模式的比較

2.2.1 GV期未成熟卵母細(xì)胞中各脂肪分布模式的比較 從圖3可見，在GV期未成熟卵母細(xì)胞中，均勻分布模式所占比例(66.00±3.26)極顯著高于半均勻分布模式(30.85±4.04)和 Peripheral分布模式(3.15 ±2.30)(P ＜0.0001，下同)，而半均勻分布模式極顯著高于外圍分布模式。可見，在GV期未成熟卵母細(xì)胞中，脂肪主要呈現(xiàn)均勻分布模式。2.2.2 MII期成熟卵母細(xì)胞中各脂肪分布模式的比較 從圖4可見，MII期的成熟卵母細(xì)胞中脂肪分布模式中，均勻分布模式所占比例(60.60±3.93)極顯著高于半均勻(35.70±4.27)和外圍分布模式(5.34±3.89)，而半均勻分布模式極顯著高于外圍分布模式?？梢?，在MII期成熟卵母細(xì)胞中脂肪多呈現(xiàn)均勻分布模式。

圖2 GV期未成熟卵母細(xì)胞及MII期成熟卵母細(xì)胞中脂肪含量的比較Fig.2 Comparison of lipid content between immature oocytes at GV stage and mature oocytes at MII stage

圖3 GV期未成熟卵母細(xì)胞中各脂肪分布模式的比較Fig.3 Comparison of lipid distribution patterns in immature oocytes at GV stage

圖4 MII期成熟卵母細(xì)胞中各脂肪分布模式的比較Fig.4 Comparison of lipid distribution patterns in mature oocytes in MII stage

表1 GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期成熟卵母細(xì)胞中各脂肪分布模式的比較Table 1 Comparison of lipid distribution patterns between immature oocytes at GV stage and mature oocytes at MII stage

2.2.3 GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期成熟卵母細(xì)胞中各分布模式的比較 由表1可見，GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期卵母細(xì)胞中脂肪Peripheral(3.15± 2.30 vs.5.34±3.89)，Semi-peripheral(30.85±4.04 vs.35.70±4.27)和Diffuse(66.00±3.26 vs.60.60±3.93)的各分布模式所占比例差異不顯著(P＞0.05)，說明水牛卵母細(xì)胞成熟前后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的脂肪分布模式?jīng)]有發(fā)生改變。

3 討論

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞中儲(chǔ)存大量的脂肪，特別是在牛、豬和山羊中含量更為豐富［13－15］。脂肪在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中起到非常重要的作用［16］，在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中，學(xué)者們通過添加與脂肪代謝相關(guān)物質(zhì)，優(yōu)化培養(yǎng)體系，用以提高卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育能力［17］。卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)是進(jìn)行胚胎體外生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一，脂肪在卵母細(xì)胞內(nèi)含量較為豐富，在卵母細(xì)胞體外成熟過程中發(fā)揮重要的作用［16］。Crocomo 等［18］的研究表明，山羊卵母細(xì)胞經(jīng)過體外成熟后，胞質(zhì)內(nèi)的脂肪比成熟前含量明顯減少。Auclair等［9］通過Nile red染色觀察，認(rèn)為牛卵母細(xì)胞成熟后的脂肪含量顯著低于成熟前含量。在本試驗(yàn)中，通過Nile red染色對水牛GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期成熟卵母細(xì)胞內(nèi)脂肪含量進(jìn)行觀察分析，發(fā)現(xiàn)MII期成熟卵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量顯著低于GV期未成熟卵母細(xì)胞，這與上述前人研究結(jié)果一致，據(jù)此推測卵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪可能作為水牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的能量物質(zhì)被卵子所利用［16］，脂肪可能作為重要的能量物質(zhì)之一影響卵子成熟效率。然而，在體外成熟過程中，體外成熟液培養(yǎng)體系影響水牛卵母細(xì)胞內(nèi)脂肪含量變化，從而提高后續(xù)受精及胚胎發(fā)育效率的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

在GV期未成熟卵母細(xì)胞中，卵母細(xì)胞中的脂肪多以均勻模式分布。在卵母細(xì)胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器中，脂肪通過轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中并發(fā)生β氧化而供能，因此其脂肪分布模式往往與線粒體的分布相關(guān)［19］。本試驗(yàn)中，GV期未成熟卵母細(xì)胞脂肪大多數(shù)呈現(xiàn)均勻分布模式，這種分布模式是否與線粒體分布存在共定位，從而利于細(xì)胞內(nèi)脂肪的氧化供能還需進(jìn)一步研究。MII期成熟卵母細(xì)胞中，卵母細(xì)胞中脂肪多以均勻模式分布，而且成熟卵母細(xì)胞均勻模式的線粒體分布與卵母細(xì)胞發(fā)育能力呈正相關(guān)［20］。前期研究結(jié)果表明大多數(shù)水牛成熟卵母細(xì)胞中線粒體呈現(xiàn)均勻分布模式［21］，說明在水牛體外成熟卵母細(xì)胞中的脂肪分布和線粒體分布模式可能存在共定位，卵母細(xì)胞內(nèi)脂肪的均勻分布模式可能利于脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)發(fā)生β-氧化，為卵母細(xì)胞發(fā)育提供能量，從而有利于水牛卵子的成熟。

卵母細(xì)胞的體外成熟過程中，依據(jù)動(dòng)物品種和卵母細(xì)胞成熟階段的不同，胞質(zhì)內(nèi)脂肪分布模式也不同。本試驗(yàn)中，水牛GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期成熟卵母細(xì)胞中，脂肪多呈現(xiàn)均勻分布模式，且這2個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞各脂肪分布模式?jīng)]有差異。前人研究結(jié)果表明，經(jīng)體外或體內(nèi)成熟后的卵母細(xì)胞，其脂肪在豬體內(nèi)多呈現(xiàn)周邊分布，而在小鼠及牛體內(nèi)多呈現(xiàn)均勻分布［22－24］;Warzych 等［24］認(rèn)為在成熟前的牛卵母細(xì)胞中，脂肪呈周邊分布，成熟后呈均勻分布，這與本研究結(jié)果相似。因此，推測細(xì)胞質(zhì)中脂肪分布模式可能會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量，而分布模式因動(dòng)物種類的不同而存在差異。在卵母細(xì)胞成熟過程中，卵母細(xì)胞中脂肪滴數(shù)量、大小和位置對卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

水牛從GV期未成熟卵母細(xì)胞到MII期成熟卵母細(xì)胞的成熟過程中，卵子內(nèi)脂肪含量顯著降低，而水牛卵母細(xì)胞成熟前后脂肪分布模式?jīng)]有發(fā)生改變，以均勻分布模式為主。