李志滿，李珊珊，陳麗雪，2，祁玉麗，2，孫印石，2※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

猴頭菇（Hericium erinaceus）隸屬猴頭菌科猴頭菌屬。據(jù)本草綱目記載，其性平、味甘，具有利五臟、助消化的功能，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的藥、食同源菌類，具有極高的醫(yī)療和保健價(jià)值。近年來(lái)研究證明，其活性成分具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種保健和養(yǎng)生功能[1，2]。本實(shí)驗(yàn)以猴頭菇為主要原料，輔以黃芪、山楂、黨參進(jìn)行活性成分提取和制粒，最終獲得猴頭養(yǎng)胃顆粒。采用大鼠急性胃粘膜損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)胃粘膜保護(hù)作用的效果，為猴頭養(yǎng)胃顆粒產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試劑

猴頭養(yǎng)胃顆粒（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室自制）；無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醛、二甲苯（北京化工廠）；蘇木素溶液、伊紅溶液（Sigma-Aldrich公司）；石蠟（徠卡儀器有限公司）；中性樹(shù)膠（上海華靈康復(fù)器械廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí) SD健康雄性大鼠 48只，體重為180g～200g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證SCXK（遼）2015-0001，合格編號(hào)211002300023526。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在溫度 20°C～25°C、相對(duì)濕度為40%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.3 儀器

IX53光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；Epoch2酶標(biāo)儀（美國(guó)博騰儀器有限公司）；EG115生物組織包埋機(jī)、EG1150C冷動(dòng)機(jī)、RM2255切片機(jī)、HI1220病理組織漂烘儀（徠卡儀器有限公司）；電子數(shù)顯卡尺605（哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限責(zé)任公司）；Heraeus Megafuge 8R高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；MS204S電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；CPA225D電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；WP-UP-WF-40微量分析型超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性胃黏膜損傷模型

參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2012版）[3]中對(duì)胃粘膜損傷有輔助保護(hù)功能的檢驗(yàn)方法。將清潔級(jí)SD健康雄性大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，猴頭養(yǎng)胃顆粒 500mg/kg、800mg/kg、1 600mg/kg 3 個(gè)組（分別相當(dāng)于受試樣品人體推薦量的3倍、5倍、10倍），每組8只。每天按10mL/（kg·bw）灌胃1次，連續(xù)30d，正常組和模型組每天給予等量的生理鹽水。末次灌胃后，嚴(yán)格禁食不禁水24h，除正常組外，所有大鼠給予無(wú)水乙醇1.0mL/只，1h后處死大鼠。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定

暴露大鼠完整胃，結(jié)扎幽門，灌注10%中性福爾馬林溶液10mL，固定20min，沿胃大彎剪開(kāi)，用生理鹽水沖去內(nèi)容物，展開(kāi)胃粘膜，記錄出血點(diǎn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量出血帶的長(zhǎng)度和寬度。因?qū)挾却頁(yè)p傷的程度較長(zhǎng)度大，故雙倍積分，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)組胃粘膜損傷積分指數(shù)和損傷抑制率。

損傷積分指數(shù)=組損傷評(píng)分總和/組動(dòng)物數(shù)量；

損傷抑制率=（模型組損傷積分-給藥組損傷積分）/模型組損傷積分 100%

表1 急性酒精損傷肉眼觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Acute alcohol injury visual criteria

2.3 病理組織學(xué)觀察

選取胃粘膜損傷最嚴(yán)重的部位，經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、透明，常規(guī)石蠟包埋厚度連續(xù)切片，經(jīng)H & E染色后，鏡下觀察大鼠胃組織病理學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠體重的影響

在急性胃粘膜損傷模型中，給予不同濃度的猴頭養(yǎng)胃顆粒30d后，各劑量組大鼠的體重增長(zhǎng)良好，呈持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài)，但各時(shí)期的體重與正常組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠體重的影響Table 2 Effect of Houtou Yangwei Granules on rat body weight ()

表2 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠體重的影響Table 2 Effect of Houtou Yangwei Granules on rat body weight ()

組別 劑量（mg/kg） 初始體重（g）15d 后體重（g）30d后體重（g）SetDoseBody weightBody weightBody weight正常組 Normal group 0 184.35±3.65 273.75±11.95 343.65±17.85模型組 Model group 0 187.07±4.69 275.70±10.10 348.55±12.95低劑量組 Low-dose group 500 185.82±3.44 271.11±6.75 339.80±14.42中劑量組 Middle-dose group 800 186.28±2.81 281.04±9.01 357.70±14.94高劑量組 High-dose group 1 600 184.66±10.15 274.75±15.55 345.35±18.45

3.2 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)急性胃粘膜損傷中胃重量的影響

經(jīng)無(wú)水乙醇刺激胃粘膜后，模型組大鼠胃組織明顯水腫，胃重量較正常組呈明顯增加趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），說(shuō)明造模成功（表3）。不同濃度的猴頭養(yǎng)胃顆粒劑量組，在給予急性乙醇灌胃后，腫脹程度明顯減輕，胃組織重量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。見(jiàn)表3。

表3 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠胃部重量的影響Table3 Effect of Houtou Yangwei Granules on the weight of rat's stomach ()

表3 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠胃部重量的影響Table3 Effect of Houtou Yangwei Granules on the weight of rat's stomach ()

注：與正常組比較，###.P＜0.001；與模型組比較，**.P＜0.01，***.P＜0.001。下表同。Note：Compare with the normal group，###.P ＜ 0.001；Compare with the model group，**.P ＜ 0.01，***.P ＜ 0.001.The same below.

組別 劑量（mg/kg） 胃重量（g）SetDoseStomach weight正常組 Normal group 0 1.80模型組 Model group 0 2.61###低劑量組 Low-dose group 500 2.14**中劑量組 Middle-dose group 800 2.11**高劑量組 High-dose group 1 600 2.06***

3.3 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷的病理形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠胃粘膜腺體排列整齊、均勻、致密；模型組大鼠胃粘膜損傷非常明顯，粘膜表面呈現(xiàn)多條條索狀出血面；不同濃度的給藥組大鼠粘膜損傷較輕，猴頭養(yǎng)胃顆粒能夠明顯減輕乙醇對(duì)胃粘膜的損傷，出血程度較輕，高劑量時(shí)只出現(xiàn)充血而無(wú)出血帶。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠胃粘膜病理學(xué)的影響Fig1 Effect of Houtou Yangwei Granules on pathology of gastric mucosa in rats

3.4 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)急性胃粘膜損傷的保護(hù)作用

模型組大鼠胃粘膜各觀察指標(biāo)中出血帶數(shù)、出血帶面積和出血帶發(fā)生率均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（###P＜0.001），表明造模成功。低劑量、中劑量、高劑量實(shí)驗(yàn)組的出血帶數(shù)、出血帶面積和出血發(fā)生率較模型組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），出血抑制率分別為19.42%、37.41%、61.87%，表明猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)急性胃粘膜損傷有明顯的保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠胃粘膜損傷指數(shù)和抑制率的影響Table 4 Effect of Houtou Yangwei Granules onrat gastric mucosal lesion indexand inhibition rate()

表4 猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)大鼠胃粘膜損傷指數(shù)和抑制率的影響Table 4 Effect of Houtou Yangwei Granules onrat gastric mucosal lesion indexand inhibition rate()

組別 劑量（mg/kg） 損傷指數(shù) 損傷抑制率（%）SetDoseLesion indexLesion inhibition rate正常組 Normal group 0 0 0模型組 Model group 0 139### 0低劑量組 Low-dose group 500 112*** 19.42中劑量組 Middle-dose group 800 87*** 37.41高劑量組 High-dose group 1 600 53*** 61.87

3.5 大鼠胃粘膜組織H & E染色的病理學(xué)觀察

正常組大鼠胃組織細(xì)胞排列緊密、有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，腺體完整，未見(jiàn)明顯異常；模型組大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞脫落、壞死，腺體排列紊亂，腺體擴(kuò)張，粘膜下層水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；各劑量猴頭養(yǎng)胃顆粒組僅見(jiàn)少量上皮細(xì)胞脫落，損傷情況均輕于模型組，其中高劑量組效果最佳。見(jiàn)圖2。

4 討論

胃粘膜損傷可能由多種原因引起，如藥物、酗酒、細(xì)菌感染、情緒變化等。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，嗜酒人群日益增多，誘發(fā)的組織器官損害引起了廣泛關(guān)注。選用急性胃粘膜損傷模型研究藥物對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用是評(píng)價(jià)胃粘膜自身防御機(jī)制對(duì)外來(lái)刺激的應(yīng)激能力和對(duì)抗強(qiáng)度的主要內(nèi)容。乙醇對(duì)胃粘膜具有很強(qiáng)的腐蝕性，能使表面粘膜層和粘液細(xì)胞受損，導(dǎo)致胃粘膜正常代謝的生理環(huán)境遭受破壞。乙醇進(jìn)入胃后，經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)化為乙醛，其與胃蛋白結(jié)合破壞胃粘膜結(jié)構(gòu)，使中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)于胃粘膜，并釋放髓過(guò)氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、氧自由基、活性氧化代謝產(chǎn)物、蛋白酶，并粘附于血管內(nèi)皮導(dǎo)致粘膜損傷[4]。高濃度的乙醇可以破壞胃黏膜屏障的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致粘膜充血、糜爛、上皮細(xì)胞壞死、脫落。由于乙醇具有脂溶性，過(guò)量飲用易造成不良后果，如胃炎、胃出血、胃潰瘍等胃粘膜損傷類疾病[5～7]。乙醇致大鼠胃粘膜損傷模型已作為探討胃粘膜損傷病理生理機(jī)制的一種普遍的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8～11]。

現(xiàn)已有研究表明，猴頭菇多糖對(duì)大鼠急性、慢性潰瘍有明顯的抑制作用，對(duì)乙醇和消炎痛所致胃粘膜損傷亦有保護(hù)作用[12]。猴頭菌片通過(guò)升高氨基己糖含量起到保護(hù)胃粘膜損傷的作用[13]。猴頭菌多糖對(duì)無(wú)水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍具有很好的抑制作用[14]。本實(shí)驗(yàn)以不同劑量猴頭養(yǎng)胃顆粒連續(xù)灌胃雄性 SD大鼠30d后，觀察用無(wú)水乙醇誘導(dǎo)的急性胃粘膜損傷的預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠胃的總重量明顯升高、出血點(diǎn)增加、胃粘膜損傷指數(shù)升高；病理切片觀察，可見(jiàn)明顯的胃粘膜上皮細(xì)胞脫落、壞死，腺體排列紊亂，腺體擴(kuò)張，粘膜下層水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，猴頭養(yǎng)胃顆粒低劑量、中劑量、高劑量組大鼠胃組織腫脹均有不同程度地減輕，出血抑制率升高，且病理結(jié)果顯示，大鼠胃粘膜病變程度也明顯得到改善。綜上述結(jié)果說(shuō)明，猴頭養(yǎng)胃顆粒對(duì)胃粘膜損傷確實(shí)具有輔助保護(hù)作用，猴頭養(yǎng)胃顆粒的研制可作為開(kāi)發(fā)胃粘膜保護(hù)作用的功能食品的一個(gè)方向。