常志光，牛慶生，劉楠楠，宋延明，王志，徐凱，閆德斌

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 吉林 132108）

蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是蜜蜂白堊病的病原體，蜜蜂白堊病是侵染蜜蜂幼蟲的一種傳染病，染上白堊病的蜂群輕則群勢減弱，重則全群覆沒。我國蜜蜂白堊病發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)定高發(fā)態(tài)勢，是當(dāng)前蜜蜂的主要病害之一。目前，人們對白堊病的防治主要以化學(xué)藥品為主，由于化學(xué)藥物極易在蜂產(chǎn)品中形成殘留，從而影響了蜂產(chǎn)品的質(zhì)量。

大蒜素（Allicin）別名大蒜新素、蒜辣素、二烯丙基二硫，是由大蒜（Allium Sativum L.）鱗莖原料提取的產(chǎn)品，是大蒜主要生物活性成分的總稱，它具有不同程度的殺菌和抑菌作用，被譽(yù)為天然殺（抑）菌劑。大蒜素因其殺（抑）菌效果顯著、無殘留、無抗藥性以及低成本等優(yōu)點(diǎn)，被作為一種綠色多功能飼料添加劑廣泛應(yīng)用于家禽、家畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1～5]。飼喂大蒜素能提高動物的抗病能力并能減少抗生素的使用，在生產(chǎn)綠色無公害的動物性食品中發(fā)揮著重要的作用。

在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中應(yīng)用大蒜治療白堊病已有報(bào)道[6～8]，為了進(jìn)一步明確大蒜素對蜜蜂球囊菌的抑菌和殺菌作用，本試驗(yàn)采用蜜蜂球囊菌為受試菌，測試不同濃度大蒜素對蜜蜂球囊菌的體外抑菌和殺菌活性，為應(yīng)用大蒜素預(yù)防和治療蜜蜂白堊病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品 大蒜素（山東辰欣藥業(yè)股份有限公司，含量99.6%，批號H20054020）。

1.1.2 菌株 蜜蜂球囊菌（A.apis） 由吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所綜合實(shí)驗(yàn)室提供，已對菌種進(jìn)行了形態(tài)、染色和生理生化反應(yīng)等鑒定[9]。

1.1.3 主要儀器 電子分析天平（JD300，沈陽龍騰電子有限公司）；恒濕恒溫培養(yǎng)箱（CTHI-250B，施都凱儀器設(shè)備上海有限公司）；冰箱（BCD-215KAGA，海爾集團(tuán)）；高壓滅菌鍋（YX280B，上海三申醫(yī)療器械有限公司）；潔凈工作臺（SCB，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）。

1.1.4 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基的配制 馬鈴薯去皮切塊100g，加入雙蒸水500mL，煮沸20min，過濾，然后加入葡萄糖10g溶解，再分別加入瓊脂10g、酵母膏 2g，用玻璃棒攪拌均勻。將青霉素（1.6 106IU）10g、鏈霉素（1.0 106IU）10g加入配制好的培養(yǎng)基中以抑制其它雜菌的生長。將培養(yǎng)基放入高壓鍋滅菌20min，滅菌后，在潔凈工作臺中把培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中備用。

1.2 抑菌試驗(yàn)

1.2.1 蜜蜂球囊菌懸液的制備 參照常規(guī)的蟲生真菌的純化方法，將純化的菌種應(yīng)用點(diǎn)植法移入PDA培養(yǎng)基上，待產(chǎn)生大量孢囊后，注入少量無菌水，置于10℃恒溫箱15min，再置于25℃恒溫箱30min，輕輕振蕩，使孢子釋放到水中，倒入裝有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩并鏡檢，直到孢子球基本都分散為單個(gè)孢子時(shí)備用[10]。

1.2.2 蜜蜂球囊菌接種量的測量 用PDA培養(yǎng)基將大蒜素倍比稀釋為1.5mg/mL、3.0mg/mL、6.0mg/mL、12.0mg/mL、24.0mg/mL、48.0mg/mL、96.0mg/mL的 7個(gè)濃度，移入平皿中備用；利用移液槍吸取蜜蜂球囊菌懸液置于試管內(nèi)，用生理鹽水以鏡檢計(jì)數(shù)方式配制成 l l07cfu/mL、l l06cfu/mL、l l05cfu/mL、l l04cfu/mL 4種濃度的菌懸液，分別接種于含不同大蒜素梯度的PDA培養(yǎng)基中。另用接種器將上述4種濃度的菌懸液接種于不含大蒜素的PDA培養(yǎng)基上，作為蜜蜂球囊菌生長的空白對照。然后，將試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)基均置于30℃ 80%濕度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察菌株生長情況，測量不同菌濃度與大蒜素最小濃度的關(guān)系，以選取適當(dāng)菌量。

1.2.3 瓊脂稀釋法測量最小抑菌濃度（MIC） 采用瓊脂倍比稀釋法測定大蒜素對蜜蜂球囊菌的MIC。用 PDA培養(yǎng)基將大蒜素倍比稀釋為 96.0mg/mL、48.0mg/mL、24.0mg/mL、12.0mg/mL、6.0mg/mL、3.0mg/mL、1.5mg/mL7個(gè)濃度的藥物梯度，用生理鹽水將蜜蜂球囊菌以鏡檢計(jì)數(shù)方式配成l l05cfu/mL的菌懸液，應(yīng)用接種器分別接種于含有不同藥物梯度的PDA培養(yǎng)基中；另做不含藥物的培養(yǎng)基接種菌懸液，作為生長菌的空白對照。試驗(yàn)組和對照組置于30℃80%的恒濕恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后觀察試驗(yàn)結(jié)果，測定菌株的MIC50和MIC90。參照陳曉月[11]的試驗(yàn)方法，并稍加改動，以無蜜蜂球囊菌生長、大蒜素濃度最低的PDA培養(yǎng)基組為大蒜素最小抑菌濃度（MIC）。1.2.4 瓊脂培養(yǎng)基法測定最小殺菌濃度（MBC） 以倍比稀釋法將大蒜素分別稀釋為 48.0mg/mL、24.0mg/mL、12.0mg/mL、6.0mg/mL、3.0mg/mL、1.5mg/mL6個(gè)濃度，接種濃度為l l05cfu/mL的菌懸液；另制不含大蒜素的瓊脂培養(yǎng)基，接種濃度為l l05cfu/mL的菌懸液作為空白對照。試驗(yàn)組和對照組置于30℃ 80%的恒濕恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，放置不同時(shí)間觀察菌株的生長情況，測定菌株的MBC50和MBC90。

以上每個(gè)試驗(yàn)組做4個(gè)重復(fù)，最后取各組平均值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌量的確定

通過對蜜蜂球囊菌株濃度與最小抑菌濃度測定，在培養(yǎng)溫度、濕度、時(shí)間相同的條件下，發(fā)現(xiàn)大蒜素的MIC與所接種的球囊菌濃度有關(guān)，由表1看出，在相同培養(yǎng)條件下大蒜素的最小抑菌濃度隨球囊菌濃度的增加而不斷提高，在球囊菌濃度范圍為l l04cfu/mL～l l05cfu/mL之間為規(guī)則上升，在球囊菌濃度繼續(xù)上升之后，大蒜素的MIC呈現(xiàn)不規(guī)則變化，為了獲得較好的數(shù)值，并獲得較一致的試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)將球囊菌株接種濃度確定為l l05cfu/mL，用于進(jìn)行抑菌和殺菌試驗(yàn)。

表1 大蒜素對不同濃度蜜蜂球囊菌的最小抑菌濃度影響Table 1 The effect of different concentrations of A.apis on the minimal inhibitory concentration of allicin

2.2 最小抑菌濃度的測定

大蒜素對球囊菌的MIC50為12.0mg/mL、大蒜素對球囊菌的MIC90為24.0mg/mL，表明大蒜素對球囊菌的MIC為12.0mg/mL。見表2。

表2 大蒜素最小抑菌濃度Table 2 The minimum inhibitory concentration of allicin

2.3 最小殺菌濃度的測定

以倍比稀釋法將大蒜素稀釋為 1.5mg/mL、3.0mg/mL、6.0mg/mL、12.0mg/mL、24.0mg/mL、48.0mg/mL6個(gè)濃度.分別測定大蒜素對蜜蜂球囊菌的最小殺菌濃度，結(jié)果表明，大蒜素對球囊菌的殺菌濃度為24mg/mL（表3）。該結(jié)果與抑菌試驗(yàn)的結(jié)果一致。

表3 大蒜素最小殺菌濃度Table 3 The minimum bactericidal concentration of allicin

2.4 不同濃度大蒜素對抑菌效果的影響

大蒜素對蜜蜂球囊菌有一定抑菌和殺菌作用，在應(yīng)用12.0mg/mL的大蒜素時(shí)，球囊菌菌圈生長直徑為13.5mm，菌落數(shù)≤50；在應(yīng)用24.0mg/mL的大蒜素時(shí)，球囊菌菌圈生長直徑為0mm，菌落數(shù)為0。數(shù)據(jù)表明，大蒜素對蜜蜂球囊菌的MIC為12.0mg/mL，MBC為24.0mg/mL，證明大蒜素對蜜蜂球囊菌具有較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用。見表4。

表4 不同濃度大蒜素對抑菌效果的影響Table 4 The effect of different concentrations of allicin on bacteriostasis

3 討論

大蒜是“地里長出來的抗生素”，因其能夠抑制和殺滅多種菌，因此有“天然廣譜抗生素”之稱[12]，大蒜素是大蒜主要生物活性成分的總稱，前人研究表明，大蒜素對變異鏈球菌、嗜水氣單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、氣單胞菌等均能產(chǎn)生抑制作用[13～16]。

多年來，養(yǎng)蜂人常使用化學(xué)藥物治療蜜蜂白堊病，但化學(xué)藥物的殘留對蜂產(chǎn)品造成污染，嚴(yán)重影響蜂產(chǎn)品的質(zhì)量。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人們對高品質(zhì)蜂產(chǎn)品的追求，很多科研人員在嘗試使用非化學(xué)藥物或方法來治療白堊病，如多功能生物制劑、中草藥、天然植物提取液以及從蜂蜜中分離的一些芽孢桿菌等。

顧宗連[17]應(yīng)用大蒜素水溶液噴灑巢脾，治療蜜蜂白堊病獲得意想不到的療效。劉厚生[18]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用拍碎的大蒜放置于巢框上防治蜜蜂白堊病非常有效。王長春[19]將大蒜搗碎成蒜泥加水定期在蜂箱內(nèi)噴灑，可起到消毒、殺菌作用。

而關(guān)于大蒜素對蜜蜂球囊菌的抑菌、殺菌研究尚未見報(bào)道，本研究屬于首次。在培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí)，大蒜素對蜜蜂球囊菌的MIC、MBC與接種細(xì)菌的濃度、培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)菌量。本試驗(yàn)先通過測定不同球囊菌濃度對大蒜素最小抑菌濃度的影響，選定受試菌的濃度為l l05cfu/mL，以期獲得準(zhǔn)確結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明：大蒜素對蜜蜂球囊菌的MIC為12.0mg/mL，MBC為24.0mg/mL，證實(shí)了大蒜素在體外對蜜蜂球囊菌具有較好的抑菌和殺菌作用。

大蒜素因其具有無抗耐藥性、低殘留、低成本等特點(diǎn)，是治療蜜蜂球囊菌的良好綠色藥物，既不會對蜜蜂造成毒害，又不會對蜂產(chǎn)品造成污染，用于治療蜜蜂白堊病具有很好的應(yīng)用前景。隨著對大蒜素抗菌機(jī)理研究的深入，著力研究和開發(fā)適合蜜蜂的大蒜素藥物，探討將大蒜素添加到50%的糖漿中，配成大蒜素糖漿飼喂蜜蜂，達(dá)到治療蜜蜂白堊病的目的。同時(shí)，研究探討用脫臭大蒜素治療蜜蜂白堊病，既能治療蜜蜂疾病，又不會對蜂群繁育造成任何影響，這些都有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。