(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093)

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，在臨床治療和科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。為了減少凍融過程對(duì)細(xì)胞造成的損傷和致死，低溫保護(hù)劑的組分及添加步驟至關(guān)重要[1]。1959年，J. E. Lovelock等[2]創(chuàng)新性地以體積分?jǐn)?shù)為10%二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護(hù)劑，同時(shí)加入體積分?jǐn)?shù)為5%～90%的血清作為冷凍儲(chǔ)存液來保存細(xì)胞。至今這兩種物質(zhì)仍然作為主要成分出現(xiàn)在保護(hù)劑配方中。DMSO能減少細(xì)胞脫水和胞內(nèi)冰的形成，維持細(xì)胞膜的完整性[3]，但高體積分?jǐn)?shù)的DMSO會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的毒性損傷。胎牛血清(FBS)常作為細(xì)胞低溫保存的血清，其保護(hù)機(jī)制是通過改變滲透壓，在冷凍時(shí)促使細(xì)胞脫水，解凍時(shí)抑制水分快速滲入并脫出胞內(nèi)的保護(hù)劑，促進(jìn)溶液玻璃化形成，保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞的完整性[4]。但FBS具有攜帶病毒、感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如異種動(dòng)物傳染病、瘋牛病等，且價(jià)格昂貴，批次之間穩(wěn)定性差[5]。

蠶絲是一種天然的高分子材料，無污染且來源豐富，主要由絲膠蛋白和絲素蛋白組成。近年來，絲膠蛋白被應(yīng)用于細(xì)胞的低溫保存領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)其具有替代FBS作為冷凍介質(zhì)的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，基于絲膠蛋白的無血清保護(hù)劑相繼成功凍存了倉鼠骨髓瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、卵巢細(xì)胞[6]，小鼠的雜交瘤細(xì)胞、大鼠胰島瘤細(xì)胞[7-9]，人的肝細(xì)胞[10]，大鼠胰島細(xì)胞[11]及牛精子和胚胎[12-13]。絲素蛋白被廣泛地應(yīng)用于藥物釋緩、骨組織修復(fù)、人工皮膚、血管等生物醫(yī)用材料的制備，以及降血糖、抑菌等醫(yī)療保健方面[14-15]。但將絲素蛋白加入低溫保護(hù)劑中，探討其是否具有低溫保護(hù)作用的潛力，目前還未有相關(guān)的公開報(bào)道。

以梅山豬耳成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，具有取材方便、效率高等優(yōu)點(diǎn)，并且體細(xì)胞和生殖細(xì)胞同樣具有全能型，可以作為動(dòng)物活體保種的有利輔助方式[16-17]。本文將蠶絲蛋白加入低溫保護(hù)劑中，用于梅山豬耳成纖維細(xì)胞的低溫保存。用絲膠蛋白替代FBS，避免因血清帶來的污染及病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，并在保護(hù)劑中添加絲素蛋白來降低DMSO的體積分?jǐn)?shù)，減少對(duì)細(xì)胞的損傷。以期研發(fā)一種基于天然蠶絲蛋白的新型、低毒性的無血清低溫保護(hù)劑，并應(yīng)用于其他細(xì)胞、組織的低溫保存實(shí)踐中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：蠶繭(廣西平果桑移天下絲綢有限公司)，梅山豬耳成纖維細(xì)胞(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院)。

試劑：絲膠蛋白(日本和光純藥)，HyClone胎牛血清(FBS)(上海博升生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。

1.2 設(shè)備與耗材

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限司)，超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，酶標(biāo)儀(英國柏楉有限公司)，程序降溫盒(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)，透析袋(美國Rebus公司)。

1.3 方法

1.3.1絲素蛋白的制備

參考文獻(xiàn)[18]的制備方法，將蠶繭除雜處理后，在質(zhì)量濃度為0.2%的碳酸鈉溶液中進(jìn)行脫膠處理30 min；得到的絲素纖維沖洗烘干后，60 ℃條件下用9.3 mol/L溴化鋰溶解4 h；將絲素蛋白溶液進(jìn)行透析、離心、濃縮等處理，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)

將豬耳成纖維細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)為20%FBS、1%丙酮酸鈉、1%雙抗、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至匯合，進(jìn)行傳代/凍存等操作。

1.3.3低溫保護(hù)劑的配制

絲膠蛋白實(shí)驗(yàn)：基礎(chǔ)凍存液為添加體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO的DMEM。對(duì)照組1和2分別為添加和不添加體積分?jǐn)?shù)為20%FBS的低溫保護(hù)劑，實(shí)驗(yàn)組3～7分別添加了質(zhì)量濃度為10%、5%、2%、1%、0.5%的絲膠蛋白來替代體積分?jǐn)?shù)為20%FBS，配制基于絲膠蛋白的新型無血清低溫保護(hù)劑。

絲素蛋白實(shí)驗(yàn)：基礎(chǔ)凍存液為添加體積分?jǐn)?shù)為20%FBS的DMEM。對(duì)照組1為添加體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO的低溫保護(hù)劑，實(shí)驗(yàn)組2～19將體積分?jǐn)?shù)為10%、8%、4%、2%、1%及不添加絲素蛋白和體積分?jǐn)?shù)為10%、5%、2.5%及不添加DMSO進(jìn)行組合，配制基于絲素蛋白的新型低毒性低溫保護(hù)劑。

篩選出絲膠蛋白和絲素蛋白的最優(yōu)濃度后，選擇最優(yōu)濃度進(jìn)行聯(lián)用，配制基于天然蠶絲蛋白的新型、低毒性的無血清低溫保護(hù)劑。

1.3.4細(xì)胞凍存

將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心去上清。每組加入1 mL配制好的低溫保護(hù)劑，輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移至2 mL凍存管。將標(biāo)記好的凍存管放入程序降溫盒中，置于-80 ℃深低溫冰箱中凍存一周。

1.3.5細(xì)胞復(fù)蘇

從冰箱中取出凍存管，在37 ℃水浴鍋中快速搖晃凍存管，直至管內(nèi)細(xì)胞懸液完全融化。室溫下5 min內(nèi)用25 ℃含血清培養(yǎng)基稀釋。離心去掉上清液，再加入1 mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

1.3.6細(xì)胞活力檢測(cè)

臺(tái)盼藍(lán)染色法[19]：取10 μL體積分?jǐn)?shù)為0.4%臺(tái)酚藍(lán)溶液和10 μL復(fù)水后的細(xì)胞懸浮液，混合均勻并靜置1 min后，滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按式(1)進(jìn)行計(jì)數(shù)：

(1)

MTT法[19]：取復(fù)溫后的細(xì)胞懸液置于96孔板中，每種低溫保護(hù)劑設(shè)置3個(gè)平行樣，另加一組新鮮細(xì)胞作為對(duì)照組，一組細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白組。每孔加入100 μL實(shí)驗(yàn)樣本，再每孔加入20 μL MTT溶液，低速震蕩融合后置于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。4 h后吸除上層溶液，每孔加入150 μL DMSO，再低速震蕩10 min。待結(jié)晶物充分溶解后，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光值，按式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

24 h貼壁率：復(fù)溫后的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收集上層培養(yǎng)液，并用D-Hanks沖洗兩遍后，收集所有上清液，計(jì)數(shù)未貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用胰酶消化后離心，取上清液，加1 mL培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。同時(shí)觀察細(xì)胞的生長情況和形態(tài)變化。按式(3)計(jì)算細(xì)胞的貼壁率：

(3)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都來自于至少3組平行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)及顯著性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 絲膠蛋白凍存細(xì)胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率

將基于絲膠蛋白的無血清低溫保護(hù)劑應(yīng)用于豬耳細(xì)胞的凍存實(shí)驗(yàn)，所得的細(xì)胞存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率如表1所示。

表1 基于絲膠蛋白低溫保護(hù)劑的細(xì)胞存活率、MTT存活率及24 h貼壁率Tab.1 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of sericin protein

注：用Duncan′s multiple range test法進(jìn)行多重比較，同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。v/v為體積分?jǐn)?shù)；w/v為質(zhì)量濃度。下表相同。

由表1可知，對(duì)照組1和對(duì)照組2的細(xì)胞存活率、MTT存活率及24 h貼壁率相比存在顯著差異(P<0.05)，說明添加體積分?jǐn)?shù)為20%FBS后能顯著提高細(xì)胞的存活率和貼壁率，添加FBS對(duì)細(xì)胞的低溫保存具有一定的作用。去除FBS后，分別添加質(zhì)量濃度為10%、5%、2%、1%、0.5%的絲膠蛋白，可以看出添加質(zhì)量濃度1%絲膠蛋白的細(xì)胞存活率及24 h貼壁率最好，且顯著高于對(duì)照組1(P<0.05)。絲膠蛋白質(zhì)量濃度從10%降至1%，細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率雖沒有嚴(yán)格按照線性變化，但呈現(xiàn)增長的趨勢(shì)。質(zhì)量濃度繼續(xù)降為0.5%時(shí)，凍存效果開始下降。說明添加質(zhì)量濃度為1%絲膠蛋白能有效替代FBS，更好地凍存細(xì)胞。

2.2 絲素蛋白凍存細(xì)胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率

將基于絲素蛋白的低溫保護(hù)劑進(jìn)行細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)，分析細(xì)胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率來驗(yàn)證細(xì)胞凍存效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

實(shí)驗(yàn)組1為對(duì)照組，添加體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率都較高，說明DMSO對(duì)細(xì)胞凍存具有顯著的保護(hù)作用。不添加絲素蛋白的情況下，DMSO體積分?jǐn)?shù)從5%降至0，細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率分別從73.37%、78.55%降至11.88%、6.86%，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，且有顯著性差異(P<0.05)。說明DMSO體積分?jǐn)?shù)的下降對(duì)細(xì)胞存活率和24 h貼壁率具有顯著影響。降低DMSO體積分?jǐn)?shù)且添加絲素蛋白后，隨著其體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，凍存效果也顯著增強(qiáng)。當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，分別添加體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、4%、8%、10%的絲素蛋白，細(xì)胞存活率和24 h貼壁率分別從68.95%、69.19%增長至89.35%、88.94%，具有顯著性差異(P<0.05)。其中5% (v/v) DMSO+ 10% (v/v) 絲素蛋白組與對(duì)照組相比，細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率均高于對(duì)照組，說明添加體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白能有效補(bǔ)償體積分?jǐn)?shù)為5%DMSO的作用效果。但是當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)，即使添加體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白，細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率均較低，說明絲素蛋白并不能完全替代DMSO。

表2 基于絲素蛋白低溫保護(hù)劑的細(xì)胞存活率、MTT存活率及24 h貼壁率Tab.2 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of fibroin protein

注：基礎(chǔ)液為添加體積分?jǐn)?shù)為20%FBS的DMEM。

圖1所示為基于絲素蛋白低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的凍存存活率影響，將保護(hù)劑1、2、3、4、17、18、19七組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。分析保護(hù)劑1、2、3可知，DMSO體積分?jǐn)?shù)從10%降至2.5%，細(xì)胞存活率雖呈下降趨勢(shì)，但影響并不顯著，說明體積分?jǐn)?shù)為2.5%DMSO就能保障較好的凍存效果。在保護(hù)劑2和3的基礎(chǔ)上添加體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白即保護(hù)劑17和18，細(xì)胞存活率分別從73.37%提高至89.35%、68.47%提高至78.47%，與對(duì)照組1相比無顯著差異(P>0.05)。說明DMSO體積分?jǐn)?shù)高于2.5%時(shí)，DMSO起主要保護(hù)作用，但添加絲素蛋白后效果更顯著。分析保護(hù)劑4和19可得，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)，添加體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白后，細(xì)胞的存活率從11.88%提高至43.07%，說明無DMSO作用時(shí)，絲素蛋白對(duì)凍存的保護(hù)作用顯著。體積分?jǐn)?shù)為5%DMSO添加體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比無顯著差異，說明體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白能部分替代DMSO的作用效果，將原有10%DMSO體積分?jǐn)?shù)降至5%。但對(duì)比保護(hù)劑1、4和19，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白并不能完全取代DMSO，單獨(dú)作用時(shí)效果不如DMSO。

圖1 基于絲素蛋白低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的凍存存活率影響Fig.1 Effect of fibroin protein on cell cryopreservation

2.3 蠶絲蛋白凍存細(xì)胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率

結(jié)合2.1及2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，絲膠蛋白的最適質(zhì)量濃度和絲素蛋白的最適體積分?jǐn)?shù)分別為1%和10%。將絲膠蛋白與絲素蛋白進(jìn)行聯(lián)用，制備基于天然蠶絲蛋白高效、低毒性的無血清低溫保護(hù)劑(DMEM+5% (v/v) DMSO+1% (w/v) 絲膠蛋白+10% (v/v) 絲素蛋白)。將該低溫保護(hù)劑用于細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞的存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率進(jìn)行分析，探究其凍存效果。結(jié)果如表3所示。

表3 基于蠶絲蛋白低溫保護(hù)劑的細(xì)胞存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率Tab.3 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of silk protien

由表3可知，基于蠶絲蛋白的復(fù)合保護(hù)劑與對(duì)照組1相比，細(xì)胞存活率與MTT存活率較低，24 h貼壁率無明顯差異；與對(duì)照組2相比，細(xì)胞存活率與MTT存活率無顯著差異，24 h貼壁率較高。說明將質(zhì)量濃度為1%絲膠蛋白與體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白聯(lián)用后，能達(dá)到較好的凍存效果。該新型低溫保護(hù)劑，用天然生物材料蠶絲蛋白既替代了FBS又降低了DMSO的體積分?jǐn)?shù)，同時(shí)保障了較高的細(xì)胞存活率和24 h貼壁率。

3 討論

血清富含生長因子、激素、氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)，含體積分?jǐn)?shù)為20%FBS的培養(yǎng)基普遍應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中[20]。FBS大多依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴，還具有攜帶病毒、感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)。絲膠蛋白是一種球狀蛋白，由18種氨基酸組成，具有良好的親水性和生物相容性，與FBS相比天然安全、來源豐富、價(jià)格低廉，并且絲膠蛋白經(jīng)高壓蒸氣滅菌和過濾除菌后作用效果不變[21]，適用于細(xì)胞的無菌培養(yǎng)。據(jù)報(bào)道[6-13]，絲膠蛋白替代FBS制備的新型無血清低溫保護(hù)劑，已經(jīng)成功凍存多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。說明在細(xì)胞的凍存中，絲膠蛋白能有效替代FBS，并維持更高的細(xì)胞活性，這與本文實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論一致。但目前還未見珍稀和優(yōu)良物種體細(xì)胞凍存研究的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)為研究其他物種體細(xì)胞的低溫保存提供了一定的參考。S. Terada等[22]發(fā)現(xiàn)添加質(zhì)量濃度為0.25%～0.5%絲膠蛋白的抗凍劑能有效減少脂質(zhì)過氧化的有害影響，防止氧化應(yīng)激，使解凍后精液質(zhì)量顯著提高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)絲膠蛋白質(zhì)量濃度高于1%時(shí)，則不利于抑制脂質(zhì)的過氧化，高濃度的滲透壓也影響精液的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)中，絲膠蛋白質(zhì)量濃度從1%提高至10%，細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率呈下降趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)[22]的結(jié)論一致。但絲膠蛋白質(zhì)量濃度低于1%時(shí)，凍存效果顯著下降。這可能與細(xì)胞的種類有關(guān)，對(duì)于豬耳成纖維細(xì)胞，絲膠蛋白濃度過高會(huì)抑制細(xì)胞表面分子進(jìn)入胞內(nèi)，引起滲透性胞內(nèi)脫水，而濃度過低則起不到足夠的保護(hù)作用。因此，針對(duì)不同的細(xì)胞類型需要篩選絲膠蛋白的最適質(zhì)量濃度。

DMSO是目前使用最廣泛的低溫保護(hù)劑，且體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO被認(rèn)為是最適合細(xì)胞凍存的體積分?jǐn)?shù)[23-24]。但DMSO的毒性隨著劑量的增加和溫度的升高而升高，細(xì)胞凍存效果明顯下降。有研究者通過添加糖類[25-26]或氨基酸類[27]物質(zhì)來減弱DMSO的體積分?jǐn)?shù)，并取得了一定成果。本文創(chuàng)新性的將絲素蛋白用于細(xì)胞的低溫保存中，以期達(dá)到削弱DMSO體積分?jǐn)?shù)或替代DMSO的作用。絲素蛋白含有豐富的氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸含量約占87%。絲素蛋白具有兩性荷電的特殊性能，天然無毒，良好的人體親和性和生物相容性等優(yōu)良性能。雖然目前對(duì)于絲素蛋白能作為低溫保護(hù)劑的作用機(jī)制尚不明確，但從絲素蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白通過酸、堿或酶徹底水解后形成絲素肽。絲素肽能與水分子之間形成較強(qiáng)的氫鍵作用，這些氫鍵的存在會(huì)減弱冰晶形成所需的相變驅(qū)動(dòng)力，未凍結(jié)水分含量降低，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[28-30]。本實(shí)驗(yàn)得出體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白能有效補(bǔ)償體積分?jǐn)?shù)為5%DMSO 的作用效果，但并不能完全替代DMSO，僅添加體積分?jǐn)?shù)為10%絲素蛋白的作用還不明顯。隨著絲素蛋白體積分?jǐn)?shù)的提高，細(xì)胞的存活率和貼壁率均有顯著提高，說明高濃度的絲素蛋白作用更顯著。但目前由于絲素蛋白制備工藝的限制，最高體積分?jǐn)?shù)只能達(dá)到10%。因此，在絲素蛋白的制備和濃度上還有一定的改進(jìn)空間。

4 總結(jié)與展望

本文以梅山豬耳成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，探究蠶絲蛋白對(duì)細(xì)胞低溫保存的效果。制備的復(fù)合型低溫保護(hù)劑1% (w/v) 絲膠蛋白+10% (v/v) 絲素蛋白+ 5% (v/v) DMSO用于凍存豬耳成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率分別為82.60%、83.02%、88.03%。該新型低溫保護(hù)劑不僅替代了FBS，部分降低了DMSO的體積分?jǐn)?shù)，還能保證較好的凍存效果。本文建立的基于天然蠶絲蛋白的低毒性、無血清低溫保護(hù)劑為其他哺乳動(dòng)物體細(xì)胞低溫保存提供了一定的參考，但對(duì)于不同的細(xì)胞，絲膠蛋白和絲素蛋白的最優(yōu)濃度和配比，能否完全替代FBS或降低DMSO體積分?jǐn)?shù)還需要進(jìn)一步研究，并且結(jié)合不同的降溫和解凍方法，以提高細(xì)胞凍融后的存活率。